LUPUS ERITEMATOSO: CONTROVERSIAS ACTUALES

PROF. DR. BERNARDO NUDENBERG

Facultad de Ciencias Médicas, UNR.

Rev Méd Rosario 67(2):119-120, 2001

RESUMEN: En base a su experiencia personal y la de otros centros dedicados a esta temática, el autor plantea algunas controversias con referencia al Lupus Eritematoso Sistémico (LES). Estos conceptos polémicos los expresa en catorce puntos referidos a:

1) Relaciones entre el Lupus Eritematoso Crónico y el Sistémico; 2) Lupus Diseminado Crónico y LES; 3) Úlceras orales; 4) Fotosensibilidad; 5) Mancha en "alas de mariposa"; 6) Lupus Profundo o Paniculitis Lúpica; 7) Lupus Neonatal; 8) Urticaria Vasculítica; 9) Livedo; 10) Tromboflebitis; 11) Lesiones en partes expuestas y no expuestas; 12) Lupus Ampollar; 13) Fenómeno de Raynaud; y 14) Livedo Vasculitis.

En este trabajo analizaremos algunos aspectos controversiales referentes al Lupus Eritematoso (LE) en sus diferentes formas clínicas. Estos conceptos surgen de nuestra experiencia de muchos años de transitar en esta temática, que atrae no solamente a dermatólogos sino a clínicos, reumatólogos y a una larga lista de especialistas en otras disciplinas médicas. No debemos olvidar que esta afección ha merecido la publicación en nuestra ciudad de un brillante libro del Prof. Dr. C. Battagliotti y colaboradores.

Vamos a sintetizar en catorce puntos los principales aspectos polémicos:

1. Uno de los cuatro signos cardinales en el diagnóstico del LE sistémico (LES), propuesto como criterio fundamental por la Asociación Americana de Reumatología (ARA), corresponde a las lesiones del LE discoideo. De hecho este concepto se refiere a las relaciones entre el LE crónico (LEC) y el sistémico. No hay dudas de que esta evolución de la forma crónica a la aguda es una posibilidad factible; aunque se sostiene que en algunas ocasiones el LES puede comenzar con lesiones discoideas. Además es bien sabido que en el LEC se pueden constatar algunas pruebas biológicas –como el FAN positivo– en una proporción también de alrededor de un 10%, sin que ello signifique certeza de evolución a LES.
2. En nuestra experiencia, que es coincidente con la de otros centros del país, este tipo de evolución o transformación ocurre en una proporción que no llega al 10%. Por lo tanto, ¿será lógico considerar a las lesiones del LEC como signo cardinal de LES?
3. Una estadística con gran número de pacientes, realizada hace pocos años en Estados Unidos por Sontheimer, demuestra que la forma diseminada o extendida crónica es la más proclive a evolucionar a LES. En nuestra experiencia y la de otros autores argentinos, este tipo de evolución se ve con más frecuencia en las formas fijas. Respecto a este punto debe tenerse en cuenta que son mucho más frecuentes estas últimas que la forma diseminada, lo que puede alterar nuestra aseveración.
4. Refiriéndonos ahora a otro de los signos cardinales del LES, las úlceras orales, no corresponde discutir su existencia, pero en nuestra experiencia su incidencia no llega al 40% de los casos. Por lo tanto sería discutible considerar a este signo como criterio diagnóstico si no se demostrara su mayor frecuencia.
5. Fotosensibilidad: No hay duda de que en el LES está siempre presente, pero debe tenerse muy en cuenta la existencia de cuadros dermatológicos con signología parecida a la del Lupus. En este grupo debemos citar al Prurigo Solar, a la Erupción Polimorfa Solar y a reacciones fototóxicas cutáneas en las que la fotosensibilidad es una condición natural, tal como en el LES.
6. La mancha eritematosa facial "en alas de mariposa" es el signo clásico y más popular del LES, pero en este punto debe tenerse en cuenta que numerosas dermatitis y dermatosis pueden simular esta lesión y confundir al observador. Recordemos en este punto a la Eccematide Seborreica, al Pénfigo Eritematoso y a la Rosácea, entre otras. Obviamente que será el dermatólogo junto al clínico los que dilucidarán los problemas de diagnóstico diferencial correspondiente.
7. El Lupus Profundo o Paniculitis Lúpica fue descripto por Kaposi en 1882 y ya este maestro de la dermatología austro-húngara había determinado que su evolución era habitualmente crónica, aunque excepcionalmente podía asociarse a un LES. Durante mucho tiempo éste ha sido un punto polémico dado que había mucha renuencia a aceptar esa eventualidad. Una última estadística que reúne los casos de Paniculitis Lúpica ocurridos en las ciudades de Nueva York y Londres en las últimas décadas aclara definitivamente la controversia: la mayoría de los casos tienen evolución crónica, pero hay un 12% de los mismos que se asocian a un LES en cualquier momento de su evolución.
8. El Lupus Neonatal, en general, es considerado como una afección de curso benigno, con regresión espontánea. Trabajos recientes han demostrado la existencia del anticuerpo Anti Ro en el cordón umbilical de los pacientes afectados de Lupus Neonatal. La inyección de la sangre de este cordón en el corazón de perros produjo lesiones cardíacas graves en la mayoría de los casos. De manera que los lactantes afectados por esta enfermedad deben tener un pronóstico reservado.
9. La Urticaria Vasculítica es una entidad que en nuestra experiencia ha estado asociada al LES, no obstante haber observado algunos casos esenciales, o sea sin relación con ninguna otra afección. A pesar de que muchos autores la consideran una contingencia rara, nosotros la hemos constatado en varios casos de LES. Puede ser un signo de comienzo o aparecer en el largo curso de esta afección. No debe olvidarse la práctica de un examen histopatológico de la lesión para confirmar el diagnóstico con el hallazgo de una vasculitis leucocitoclástica.
10. Livedo. Para nosotros la constatación de este signo vasculítico en un LES ha sido de mal pronóstico. No obstante en estos últimos años se ha abierto una gran polémica al haberse producido remisiones. Según nuestra experiencia, el mecanismo desencadenante de la Livedo ha sido en muchos casos el Síndrome de los Anticuerpos Antifosfolípidos (SAF), que muchas veces conlleva la producción de trombos en áreas vitales como el cerebro, corazón y riñón con la lógica gravedad. Cabría entonces la posibilidad de un SAF limitado y con duración no muy prolongada.
11. La tromboflebitis que aparece en el curso de la evolución de un LES no es tan rara. La explicación de este proceso dio lugar a muchas interpretaciones, pero desde el descubrimiento del SAF muchos autores, a los que nos sumamos, piensan que éste es el único mecanismo que lo desencadena. Por lo tanto valen las mismas consideraciones del punto anterior respecto a su pronóstico.
12. Existe el concepto bastante generalizado respecto a las lesiones eritematosas del LES –incluida la mancha facial "en alas de mariposa"–, que sólo se observan en partes descubiertas de la piel. En nuestra experiencia no es raro constatarlas en tronco, abdomen, y otros sectores cubiertos.
13. Hay algunos autores que pretenden considerar una nueva forma clínica de LES, que correspondería al llamado Lupus Ampollar. En bien sabido que las ampollas en el LES pueden presentarse en una proporción de alrededor del 3% de los casos. En la mayor parte se asocia a formas subagudas de esta afección. Por lo tanto, creemos que sumar como nueva forma clínica un tipo de presentación que no es nada común es dificultar la comprensión de esta entidad clínica bastante compleja de por sí.
14. Existe la noción, especialmente entre los clínicos, de que el fenómeno de Raynaud es muy frecuente en el LES. Creemos que esta idea es errónea. En efecto, lo observamos sólo entre un 15 y un 20% de nuestra casuística. Lo contrario ocurre en la Esclerodermia Sistémica Progresiva, donde la cifra alcanza a un 95% de los casos.
15. La Livedo Vasculitis es una entidad descripta en 1967 por Bard y Winkelmann, que consiste en una arteritis segmentaria con producción de úlceras en las piernas, con aparición en la temporada estival. Hay muchos autores que la asocian en forma constante con el LES. Nosotros hemos visto casos totalmente independientes del mismo, y en alguna oportunidad asociación de ambas afecciones. Se trata indudablemente de un tema controversial, que se resolverá con estadísticas más amplias.

Bibliografía:

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TERAPIA GÉNICA: El Desafío terapéutico del siglo XXI

O. Graciela Scharovsky

Instituto de Genética Experimental, Facultad de Ciencias Médicas, UNR.

Resumen

La terapia génica es una forma de medicina molecular que probablemente tendrá un gran impacto en la salud humana a lo largo del siglo XXI. Tiene como objetivo modificar o reparar una alteración genética adquirida, corregir un error génico de nacimiento o dotar a una célula con una nueva función. Los avances recientes de la Biología Molecular y de la tecnología del ADN recombinante han hecho posible el desarrollo de este tipo de enfoque terapéutico. Esta novedosa metodología puede llegar a tener profundas implicancias en la forma en que se traten las enfermedades en el futuro. Se describen los distintos tipos de terapia génica que se están desarrollando en la actualidad, los requisitos que se deben cumplir para poder aplicarlos eficientemente, las desventajas de cada método, los genes más comúnmente transducidos y sus vías de administración. También se analizan las patologías hereditarias o adquiridas que son susceptibles de ser tratadas con terapia génica, tales como enfermedades neoplásicas, infecciosas, del sistema inmune o que afectan a diferentes órganos, así como las distintas estrategias implementadas para llevarla a cabo.

Palabras clave: terapia génica, transducción, sistemas vectores, genes suicidas, terapia antisentido.

Summary

GENE THERAPY: THE THERAPEUTIC CHALLENGE OF THE XXIst CENTURY.

Gene therapy is a type of molecular medicine that will probably have a significant rol in human health along the XXI century. Its goal is to modify or repair an adquired genetic alteration, to correct a congenital genetic error or to give a cell a new function. The recent advances in molecular biology and DNA recombinant technology have made it possible to develop this novel therapeutic approach. Gene therapy will likely have in the future enormous influences on the treatment of different illnesses. In this review, the different types of gene therapy currently developed, the disadvantages of each method, the most commonly transduced genes, and their ways of administration are explained. Also, the hereditary or acquired pathologies amenable to enter in gene therapy protocols, like cancer, infectious or immune system diseases, or pathologies involving differents organs, as well as the different strategies generated are described.

Key words: Gene therapy, transduction, vector systems, suicide genes, antisense therapy.

La terapia génica es una forma de medicina molecular que, sin lugar a dudas, tendrá un gran impacto en la salud humana a lo largo del siglo XXI. Es una técnica que utiliza al ácido nucleico como molécula terapéuticamente útil. Tiene como objetivo modificar o reparar una alteración genética adquirida, corregir un error génico de nacimiento o dotar a una célula con una nueva función, mediante el reemplazo de un gen deficiente por uno normal, la corrección de un gen anormal, o la introducción de un gen terapéutico no relacionado en las células apropiadas. Esta estrategia terapéutica se basa en el empleo de la transducción génica, que consiste en la introducción de genes exógenos en una célula blanco mediante un sistema vector adecuado.

Hasta no hace mucho tiempo, una terapia génica exitosa se podía pensar solamente en el terreno de la ciencia-ficción. Sin embargo, los avances recientes de la biología molecular y de la tecnología del ADN recombinante, que condujeron a la identificación de muchos genes importantes de enfermedades humanas y de sus productos proteicos, la han convertido en realidad. Se abrieron así nuevas oportunidades para la investigación y, como consecuencia de ello, para el planteo de nuevas estrategias terapéuticas en el manejo de muchas enfermedades, tanto genéticas como adquiridas.

Es importante señalar que, aunque en la actualidad se presente a la terapia génica como la nueva panacea en medicina, su impacto terapéutico en el futuro inmediato va a ser limitado, debido a la existencia de una serie de dificultades técnicas no resueltas hasta el momento. El éxito de su aplicación dependerá del esfuerzo conjunto de investigadores de las ciencias básicas y clínicas que deberán superar eficientemente tales dificultades.

A partir de 1988, fecha del primer protocolo autorizado en los Estados Unidos de América (EUA), se han desarrollado en todo el mundo más de 500 protocolos clínicos de terapia génica (principalmente de fase I y II) para el tratamiento en especial del cáncer y de patología hereditaria de tipo monogénico. En épocas muy recientes se han incorporado protocolos para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares y del SIDA. En la actualidad existen numerosos protocolos pre-clínicos en ejecución que estudian la factibilidad del empleo de terapia génica para el tratamiento de diversos tipos de patologías, tales como alergias, enfermedades autoinmunes, enfermedades neurológicas y regeneración de tejidos.

En la Tabla I están indicados el número de protocolos y de pacientes implicados en ellos por continente, en un relevamiento llevado a cabo en febrero de 2001 ¹. Es de hacer notar que de los 534 protocolos indicados la mayor parte se llevaron o llevan a cabo en EUA (407; 76.2%), en el Reino Unido (43; 8.1%), en Francia (15; 2.8%), en Canadá (11; 2.1%), y en Alemania (10; 1.9%), correspondiendo el resto a diferentes países.

Como se puede observar en la Tabla II ¹, el tratamiento del cáncer es la indicación más frecuente para este tipo de terapia, siguiéndole en importancia las enfermedades monogénicas, la marcación génica y las enfermedades infecciosas.

Tipos de terapia génica

Teóricamente, son posibles dos tipos de terapia génica en las que: 1) las células somáticas, ó 2) las células de línea germinal son modificadas genéticamente para corregir el defecto genético.

La terapia de células somáticas consiste en el tratamiento de la enfermedad genética en determinadas células del individuo, pero si el mismo es portador de una mutación heredada, la progenie podría heredar el gen mutante; es decir que se "curarían" las células tratadas pero no el resto de ellas, portadoras de la mutación. Por otra parte, la terapia de las células germinales resultaría en una cura completa, ya que el gen mutante sería reemplazado por el gen normal, dando lugar así a células normales en la totalidad del individuo.. Mientras que ambos tipos de terapias han sido desarrolladas en organismos no humanos, solamente la terapia de células somáticas se ha intentado en humanos, debido a los problemas éticos del tratamiento de células germinales. Existe acuerdo universal de que la terapia génica de línea germinal es moralmente y éticamente inaceptable. Por lo tanto, todos los programas se enfocan a la terapia génica de células somáticas, en las que la alteración en la información genética está dirigida a células, tejidos u órganos específicos en los cuales el desorden es manifiesto.

Es muy extensa la cantidad de material escrito y publicado acerca tanto del uso potencial como del abuso de la terapia génica. Varios países ya han establecido cuerpos regulatorios para controlar los aspectos técnicos, terapéuticos y de seguridad de los programas de terapia génica. Tanto en los EUA como en el Reino Unido se ha determinado la necesidad de controles rigurosos ejercidos por distintos tipos de comités (FDA, Comité asesor de ADN recombinante en EUA y Comités de Ética de la Terapia Génica en Gran Bretaña) para la aprobación de este tipo de programas. De todos modos, todavía no se ha llegado a un consenso universal acerca de las regulaciones y controles que se deberían implementar para asegurar la rigurosidad científica en este tipo de terapéutica y la seguridad en su aplicación. La polémica continúa y seguramente los años venideros traerán novedades al respecto ².

Requisitos para la terapia génica

Para que una patología determinada pueda ser tratada efectivamente con terapia génica, deben cumplirse una serie de condiciones fundamentales:

• En primer lugar, y como es obvio, el gen terapéutico que se desea introducir debe haber sido clonado. Esta información debería incluir no solamente el gen estructural, sino también las secuencias de ADN involucradas en el control y regulación de la expresión del gen. Este requisito parece obvio, pero alguno de los primeros intentos de terapia génica experimentales se llevaron a cabo al principio de los años 80, cuando se sabía muy poco acerca de control de los genes estructurales o de regiones regulatorias necesarias para la expresión del gen. De esa manera, las posibilidades de éxito eran mínimas.
• Se debe contar con un método eficiente y seguro para introducir dicho gen en la célula blanco. Si la terapia génica quiere ser considerada como una alternativa realista al tratamiento convencional, debe haber evidencia inequívoca, proveniente de proyectos de terapia génica llevados a cabo en animales, de que el gen insertado funciona apropiadamente, con secuencias regulatorias, promotoras y exacerbadoras adecuadas. Además, se debe demostrar que el tejido o población celular tratados tienen un tiempo de vida razonable, que el producto génico continúa expresándose, y que el organismo no reacciona en su contra, por ejemplo produciendo anticuerpos contra el producto proteico.
• Las células específicas, el tejido o el órgano de una persona con un desorden genético, deben estar identificados y ser accesibles. Por ejemplo, los primeros intentos de tratar la beta-talasemia, un desorden hereditario de la hemoglobina, involucraban a todas las células de la médula ósea, mientras que lo correcto sería tratar específicamente el pequeño número de células madre de médula ósea a partir de las cuales se originan las células rojas inmaduras y los reticulocitos.
• Finalmente, es esencial demostrar que la introducción del gen foráneo o secuencia de ADN no tiene efectos deletéreos, tales como llevar inadvertidamente a una enfermedad maligna, o efecto mutagénico, tanto en células somáticas como en germinales. La posibilidad de afectar a las células germinales debe ser considerada, aun cuando el tratamiento se dirija a las células somáticas.

Métodos de terapia génica

La terapia génica puede ser realizada tanto ex vivo (o in vitro) como in vivo.

La metodología ex vivo consiste en el tratamiento in vitro de las células o tejidos de un individuo afectado o de un donante, a las que se les tranfiere, con diferentes vectores, el gen terapéutico, para ser luego introducidas como un injerto en el sitio de interés.

La metodología in vivo emplea vectores de ADN recombinante para transducir las células somáticas con el gen terapéutico, directamente en el paciente, cuando las células no pueden ser cultivadas o reemplazadas en el individuo afectado.

La célula a la que se le ha introducido un gen en forma artificial es llamada célula transgénica, y al gen involucrado se lo denomina transgen.

Sistemas de transferencia génica

Para la transfección, tanto in vivo como ex vivo, se utilizan distintos vectores, es decir diferentes sistemas que permiten introducir el ADN en la célula de interés. En general, podemos clasificarlos en sistemas virales y no virales.

Sistemas virales

Se pueden utilizar una serie de virus diferentes para transportar el material genético foráneo dentro de las células. Cada uno de ellos tiene ventajas y desventajas particulares.

Retrovirus

Son los virus a ARN ^3,4; derivan de una familia de virus que incluyen el virus humano de la inmunodeficiencia y virus que en ciertas especies pueden causar cáncer. Son los sistemas vectores virales más desarrollados y utilizados hasta el momento. Penetran en las células a través de receptores específicos

Los retrovirus usados en terapia génica son manipulados con metodología de ADN recombinante de tal manera que se les incorpora el gen terapéutico y se los vuelve incapaces de replicarse en forma independiente, con el objeto de no producir efectos colaterales asociados con la infectividad viral.

Estos virus portan su información genética en forma de ARN; sin embargo, una vez que el virus infecta a la célula, el genoma de ARN se transcribe hacia atrás en la forma de ADN, utilizando la enzima transcriptasa reversa, y se integra al ADN de la célula infectada. Este ADN viral se llama provirus, se integra de manera estable y se expresa como cualquier otro gen de la célula huésped. El provirus así formado es el molde para la produccción de los ARNm para los varios productos génicos virales. Si el virus está integrado en forma estable en células progenitoras en división, todas las progenies subsiguientes de células heredarán una copia del genoma viral.

Una de las desventajas del uso de retrovirus es que sólo pueden portar y, por lo tanto, introducir en la célula blanco, secuencias pequeñas de ADN, usualmente menos de 8kb, limitando su uso en terapia génica. Muchos de los genes a introducir son más grandes de lo que se puede incorporar en un retrovirus. Una segunda desventaja es que estos retrovirus sólo pueden infectar una célula que está en división. Es decir que las células en G₀ no son transfectadas. Otras desventajas son: su inestabilidad, el hecho de que no se puede excluir completamente la posibilidad de contaminación con retrovirus competentes o de que se produzca el empaquetamiento de ARN con potencial oncogénico

Adenovirus

Los virus a ADN ^3,4 pueden ser usados como vectores en terapia génica, ya que infectan una gran variedad de células. Los vectores adenovirales para terapia génica son adenovirus que han sido modificados genéticamente por deleción de parte del genoma viral, de tal manera de crear espacio para portar un gen extraño al mismo. Tienen ventajas sobre los retrovirus porque son estables y pueden ser fácilmente purificados para producir títulos altos para la infección. A diferencia de los retrovirus, pueden infectar células que no están en división y pueden llevar hasta 36 kb de ADN extraño.

Los adenovirus no se integran en el genoma del huésped, lo que evita la posibilidad de mutagénesis insercional, pero tienen la desventaja de que la expresión del gen introducido es generalmente inestable y transitoria. Además, en virtud de su infectividad, pueden producir efectos adversos secundarios a la infección, por estimulación de la respuesta inmune del huésped a los antígenos adenovirales ⁵. Por último, los adenovirus contienen genes conocidos que están involucrados en la transformación maligna, de tal manera que constituyen un riesgo potencial de inducción de una enfermedad maligna.

Sistemas no virales

Liposomas

Los liposomas son esferas huecas de 0.025 a 1 micra de diámetro, compuestos por una variedad de lípidos dispuestos en una o varias láminas, que tienen una cara hidrofílica hacia el exterior y otra hacia el interior. De esta manera están habilitados por un lado, para transportar en su interior moléculas hidrofílicas como los genes terapéuticos y por otro, para atravesar la membrana celular dada su liposolubilidad. Los liposomas se forman espontáneamente cuando se suspenden ciertos lípidos en solución acuosa. De acuerdo a su carga se clasifican en liposomas aniónicos o catiónicos, siendo estos últimos los más eficientes para la transferencia génica. Esta metodología tiene la gran ventaja de ser obviamente no infectiva y de poder cargar secuencias de ADN mucho más largas que en los sistemas virales. Entre las desventajas se pueden nombrar la baja eficiencia de transfección y la expresión transitoria del transgen. La entrega génica con liposomas es utilizada preferentemente para terapia génica in vivo de diversos tejidos ⁴.

Transferencia de ADN desnudo

La transferencia directa de ADN purificado de plásmido produce una expresión transitoria del transgen. Esta metodología ha demostrado ser eficiente solamente en músculo esquelético o cardíaco ³.

Endocitosis mediada por receptor

Otra forma de transferir un gen es unir el ADN a ligandos polipeptídicos que son reconocidos por un receptor presente en la superficie de la célula que se quiere transfectar. Por ejemplo, el ADN unido a una proteína que tenga galactosa será reconocido por los receptores en la superficie de las células hepáticas que son específicos para glicoproteínas que tienen una galactosa terminal. La unión del complejo ADN-ligando al receptor provocará la internalización del mismo en vesículas endocíticas que son transportadas a los lisosomas donde el complejo es degradado. Para que el gen pueda expresarse tiene que escapar del lisosoma sin ser degradado. La eficiencia de transfección de este sistema es baja.

Oro coloidal

El ADN de plásmido puede ser unido a partículas de oro coloidal de 1 micra de diámetro y luego disparadas a gran velocidad, mediante distintas técnicas, hacia las células que se desea transducir. Como el ADN así entregado no tiene mucha penetración, puede ser utilizada en la terapia génica de células superficiales. Dadas sus características se la conoce como la técnica de la pistola genética.

Tipos de genes

La variedad de genes involucrados en protocolos de terapia génica tanto experimentales como clínicos, es muy grande. Los genes utilizados más frecuentemente incluyen: a) citoquinas, como GM-CSF , IFN-a , b ó g , IL-2 , IL-4 , IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, TNF-a ^6-10; b) antígenos, como CEA, gp100, HIV-IT, HLA-B7, MART-1, PSA, SPARC ^11-14, etc.; c) deficientes, como AAT, ADA, CD18, factor IX, etc. ^15-17; d) suicidas, como CD (citosina desaminasa), Enterotoxina B del Staphylococcus, TK (tirosina quinasa) ^18,19; e) supresores tumorales, como BRCA1, p53, Rb ^20,21.

Procedencia de las células transducidas

Cerca del 90% de los protocolos de terapia génica utilizan células autólogas para transducir el gen terapéutico. En ocasiones, cuando un paciente infectado con HIV presenta la posibilidad de reinfección por transplante de sus propias células sanguíneas, se utilizan células singeneicas, por ejemplo provenientes de un hermano mellizo no infectado. En algunos protocolos se emplean células alogeneicas e inclusive xenogeneicas.

Vías de administración

Las diferentes patologías a tratar plantean la necesidad de utilizar distintas vías de administración del gen terapéutico. En orden decreciente de frecuencia, las vías más utilizadas son la intratumoral, intravenosa, subcutánea, transplante de médula ósea, intradérmica, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, etc.

Terapia génica antisentido

Hasta ahora hemos hablado de un tipo de terapia génica en la que la molécula de ADN que se introduce en las células tiene el mismo sentido que el gen que se quiere introducir, es decir el sentido 5’-3’, o sea que introducimos el gen propiamente dicho. Este tipo de terapia génica se llama sentido o más comúnmente "sense" y, como señalamos anteriormente, tiene como objetivo lograr la expresión de dicho gen o, dicho de otra manera, la ganancia de una función. Pero también se puede llevar a cabo un tipo de terapia génica llamada antisentido o "antisense", la cual tiene como objetivo la inhibición de la expresión de un gen determinado, es decir, la pérdida de la función ejercida por la proteína que codifica el gen alterado.

En la terapia génica antisentido se utilizan oligonucleótidos que se sintetizan para que se unan a secuencias específicas de ARN.

La forma más simple de esta "droga genética" es un pequeño trozo de ADN, un oligodesoxinucleótido, que tiene el sentido 3’-5’, es decir, el contrario al sentido normal de lectura 5’-3’ y que se une por complementariedad de bases de Watson-Crick a una secuencia determinada de ARN. Esta sustancia puede ser sintetizada químicamente y administrada a la célula o tejido a tratar, o puede ser producida biológicamente, por ejemplo por el uso de un vector apropiado, como un plásmido o un virus atenuado en la forma de un ARNm antisentido. La otra forma relacionada es la que utiliza ribozimas que son ribo-oligómeros catalíticos que degradan en una secuencia determinada al ARNm complementario, luego de unirse al mismo vía el apareamiento de bases. Las dos modalidades mencionadas pueden bloquear el procesamiento del ARN y la subsiguiente traducción. Se han propuesto diversos mecanismos para explicar estos efectos. Este tipo de enfoque terapéutico ha despertado muchas esperanzas y es muy atractivo por la simplicidad de una idea elegante. Pero, en la práctica, así como en cualquier modalidad terapéutica, aparecen los problemas, los cuales podrían ser resumidos de la siguiente manera: 1) degradación del oligómero in vivo, 2) captación ineficiente por parte de la célula, 3) unión no específica, 4) rotura del ARN no específica.

 

Enfermedades tratables con terapia génica

Enfermedades neoplásicas

Las estrategias para el tratamiento de las enfermedades neoplásicas están evolucionando rápidamente. Mientras que la quimioterapia se aplica fundamentalmente para reducir grandes masas tumorales, se ha puesto gran atención en el desarrollo de nuevas terapias para eliminar la enfermedad residual. Dentro de esta tendencia, distintas estrategias basadas en la terapia génica están siendo utilizadas para el tratamiento biológico de los tumores: I) estimulación de la respuesta inmune, II) genes suicidas, III) transferencia de genes supresores tumorales, IV) inactivación de oncogenes, V) genes de resistencia a drogas.

Estimulación de la respuesta inmune

La administración sistémica de citoquinas con el objeto de amplificar una respuesta inmune antitumoral ya establecida, o de inducir nuevas células efectoras, tiene el inconveniente de su gran toxicidad. La alternativa planteada fue la introducción de citoquinas en las células tumorales mediante técnicas ex vivo e in vivo. Existen numerosos informes de experimentos en los cuales se ha demostrado que la transferencia génica de citoquinas individuales, incluyendo Interleuquinas 1, 2, 3, 4, 6, 7, 10, 12, IFNg , TNFa , GM-CSF y G-CSF, ha logrado inducir respuestas inmunes antitumorales que estuvieron acompañadas de grados muy variables de rechazo tumoral ^6,8,22,23.

Otra forma de estimular la respuesta inmune antitumoral consiste en administrar vacunas de antígenos tumorales. La forma más frecuente consiste en transfectar células dendríticas autólogas, que son las mejores células presentadoras de antígenos, con ADN o ARNm que codifica para antígenos tumorales y administrárselas al paciente. Este procedimiento disparará una respuesta linfocitaria antitumoral. El antígeno CEA en cáncer de colon y el MART1 en melanoma se han utilizado para este tipo de estrategia terapéutica ^24,25.

Los linfocitos T (LT) requieren dos señales para activarse. La señal uno es generada por la interacción entre el receptor para el antígeno del LT y el complejo formado por el antígeno y las moléculas del CMH (Complejo Mayor de Histocompatibilidad) pertenecientes a las células presentadoras de antígenos. La segunda señal es provista por moléculas co-estimulatorias de las células presentadoras, especialmente la molécula B-7 que se une a los receptores CD28 y CTLA4 del LT. Sin la señal co-estimulatoria las células T no pueden responder al antígeno. Muchas células tumorales carecen de la molécula B-7, lo que dificulta su reconocimiento por los LT. La transfección de B-7 en células tumorales ha resultado en regresiones tumorales, por ejemplo en tumores cerebrales ⁷.

Genes suicidas

Los genes suicidas transferidos a células tumorales permiten diferenciar artificialmente estas células de las normales, ya que codifican para una enzima que es capaz de modificar una pro-droga no tóxica, convirtiéndola en un metabolito tóxico que lleva a la muerte de la célula. El sistema más utilizado es el integrado por el gen de la timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-TK) y la pro-droga ganciclovir o aciclovir ¹⁸. El ganciclovir fosforilado inhibe la síntesis de ADN no solamente en las células transducidas sino también en las células vecinas (efecto "bystander"). Otro sistema ampliamente explorado es el del gen de la citosina desaminasa (CD) de E. coli y la pro-droga 5-fluorocitosina ²⁶.

Transferencia de genes supresores tumorales

La ausencia de genes supresores tumorales o la pérdida de su función por diversas alteraciones anula las vías de señalización que inducen la muerte celular por apoptosis y contribuyen así a la falta de control del crecimiento celular. La restitución del gen supresor tumoral salvaje, por transferencia génica, le devuelve a la célula un mecanismo normal de control proliferativo que tiene efecto antitumoral. El gen supresor tumoral p53, el más frecuentemente mutado en los tumores humanos, ha sido objeto de mucha investigación en protocolos de terapia génica, obteniéndose resultados alentadores ^20,27.

Inactivación de oncogenes

En todos los tumores existen oncogenes que junto con los genes supresores tumorales son responsables del crecimiento neoplásico. La inhibición de su expresión, permitiría el retorno al crecimiento celular normal y a la desaparición del fenotipo maligno.

Para ello se ha desarrollado una técnica que se denomina terapia génica antisentido que consiste en la tranferencia de un oligonucleótido de ADN que tiene la secuencia antisentido, es decir la secuencia complementaria, del ARNm que codifica para la proteína anormal cuya expresión se quiere eliminar. La unión del oligonucleótido antisentido con el ARNm correspondiente por complementariedad de bases a nivel del ribosoma, impide la síntesis de la proteína oncogénica. Ensayos experimentales con el oligonucleótido antisentido BCR-ABL demostraron supresión del crecimiento de células leucémicas ²⁸.

Genes de resistencia a drogas

La labilidad genética de los tumores favorece la generación de resistencia a los agentes quimioterápicos. Las células tumorales son capaces de evitar los efectos citotóxicos de dichos agentes mediante la expresión de genes capaces de eliminarlos o impedir su acción tóxica. Por ejemplo, la glicoproteína P, codificada por el gen MDR (resistencia a multidrogas), es una proteína de transmembrana que funciona expulsando el fármaco de la célula tumoral, impidiendo así su acción sobre la misma. El conocimiento a nivel molecular de este efecto indeseable en la quimioterapia de los tumores ha permitido plantear su utilización en provecho del paciente. La quimioterapia en altas dosis está limitada por su toxicidad a nivel de la médula ósea. La transferencia del gen MDR en células hematopoyéticas precursoras reinoculadas en el paciente, las convierte en resistentes al fármaco tóxico y permite utilizar dosis mucho mayores con muy buena tolerancia ²⁹.

Enfermedades del Sistema Inmune

La terapia génica está siendo considerada como un nuevo recurso terapéutico útil para el tratamiento de diversos desórdenes del sistema inmune tales como las enfermedades autoinmunes y las inmunodeficiencias.

Enfermedad autoinmune

El nuevo enfoque terapéutico ³⁰ presenta al menos tres estrategias posibles que consisten en modificar genéticamente: a) las células blanco del ataque autoinmune (sinoviocitos en la artritis reumatoidea, células b del islote pancreático en la diabetes tipo 1, etc.), de tal manera que expresen citoquinas inmunoregulatorias que las protejan de la destrucción autoinmune; b) las células T autorreactivas, de modo que produzcan citoquinas antiinflamatorias que disminuyan la severidad de la lesión autoinmune; c) las células blanco y/o las autorreactivas para que sinteticen proteínas transgénicas tales como factores de crecimiento que ayuden a la reparación del tejido alterado.

Las citoquinas proinflamatorias IL-2, IFNg y TNFa producidas por células Th1 parecen ser responsables de muchas enfermedades autoinmunes, mientras que las antitinflamatorias IL-4 e IL-10 provenientes de células Th2 podrían tener un rol regulatorio. La transfección del gen de IL-4 en células b pancreáticas de ratón diabético no obeso (NOD) los protegió de la insulitis que desarollan espontáneamente ³¹. Utilizando otra estrategia, se transfectaron con IL-10 clones Th1 específicos para células b , los cuales transferidos a ratones NOD inhibieron la incidencia de diabetes ³².

Inmunodeficiencias

La deficiencia de la adenosindesaminasa (ADA) produce una forma de inmunodeficiencia combinada severa con acumulación de trifosfato de desoxiadenosina, sustancia tóxica para los linfocitos. Como consecuencia de ello, las respuestas inmunes celulares y humorales son deficientes, llevando al desarrollo de infecciones graves y finalmente a la muerte. Resultados experimentales previos mostraron la posibilidad concreta de lograr la correción de la deficiencia. Actualmente, están en marcha estudios clínicos para el tratamiento de esta patología por transferencia del gen ausente en células hematopoyéticas precursoras ¹⁶.

El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es la patología con deficiencia del sistema inmune más frecuente. Para su tratamiento se están desarrollando diversos ensayos preclínicos que enfocan la solución del problema desde distintas perspectivas como por ejemplo, transfección de un gen que previene la replicación del HIV ³³ o terapia génica antisentido para inhibir la producción de la enzima integrasa del virus.

Enfermedades infecciosas

El tratamiento de las patologías causadas por agentes infecciosos también está siendo explorado desde la perspectiva de la terapia génica. El problema puede ser encarado de diferentes formas, todas tendientes a eliminar el microorganismo, ya sea en forma directa, o bien en forma indirecta, vía la estimulación del sistema inmune o la utilización de diferentes drogas.

La expresión viral puede ser inhibida utilizando terapia génica antisentido, por ejemplo, durante la infección por HIV ³⁴ y por HTLV-I ³⁵. Otra forma de tratamiento consiste en transfectar genes suicidas seguidos de la administración de la pro-droga correspondiente. También, las transferencias génicas pueden hacerse con el objeto de estimular la síntesis de un anticuerpo específico para un patógeno determinado ³⁶.

Enfermedades que afectan diferentes órganos

Pulmones

La fibrosis quística (FQ) y el enfisema pulmonar son las enfermedades hereditarias que afectan a los pulmones de mayor frecuencia. En ambos casos se están ensayando terapias génicas de reemplazo. La transfección con liposomas del gen salvaje CFTR (que se encuentra mutado en la fibrosis quística), en vías respiratorias, restaura la secreción de cloruros en ratones transgénicos . En la actualidad se espera poder tratar pacientes con FQ utilizando esta metodología ³⁷. Con respecto al tratamiento del enfisema familiar, ya existen protocolos clínicos en los que se administra el gen deficiente (AAT) por lipofección, vía nasal ¹⁵.

Hígado

La relativa facilidad de acceso hepático in vivo, o la posibilidad de transducción in vitro de hepatocitos obtenidos quirúrgicamente, ha posibilitado que se ensayen diversas terapias génicas para el tratamiento de enfermedades hepáticas tanto hereditarias como adquiridas. Se han desarrollado protocolos para el tratamiento de hepatitis B ³⁸ y de tumores hepáticos ³⁹. Dentro de las enfermedades de herencia monogénica, algunos pacientes con hipercolesterolemia familiar, patología debida a una deficiencia en el receptor de LDL (lipoproteína de baja densidad), han entrado en protocolos clínicos de terapia génica. Los hepatocitos de los pacientes, obtenidos por hepatectomía parcial, se transducen ex vivo con el ADN del receptor de LDL ⁴⁰.

Perspectivas futuras

El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante y la identificación y clonado de numerosos genes, principalmente durante la última década, hicieron posible convertir en realidad lo que parecía una fantasía: utilizar el ADN como un producto farmacéutico convencional. Es así que la terapia génica, que era hasta hace poco sólo una elucubración teórica, es en la actualidad una nueva modalidad terapéutica que está siendo probada en varias enfermedades, tanto genéticas como adquiridas. Esta novedosa metodología puede llegar a tener profundas implicancias en la forma en que se traten las enfermedades en el futuro.

Sin embargo todavía resta mucho camino por andar. Se tendrá que obtener un mejoramiento substancial de los sistemas vectores y de las tecnologías relacionadas con ellos. También será necesario evitar la toxicidad y las actividades inespecíficas y, por otro lado, aumentar la intensidad y duración del efecto deseado, sea éste expresar o anular la expresión de un gen determinado. Una vez logrado todo lo anterior, se tendrá que demostrar que lo que funcionó a la perfección en un sistema animal, también puede lograrse en un ser humano.

El sendero a recorrer parece largo y difícil pero, sin lugar a dudas, la conjunción del tiempo con el esfuerzo científico que se está llevando a cabo en numerosos grupos de investigación de todo el mundo, llevará, en un futuro cercano, a la aplicación clínica de esta nueva modalidad terapéutica en patologías de muy diversa índole.

Referencias

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Tabla I. Protocolos de terapia génica por continente*

Continente	Protocolos		Pacientes
	Número	%	Número	%
América	418	78.3	2208	63.7
Europa	99	18.5	898	25.9
Asia	9	1.7	32	0.9
Australia	3	0.6	13	0.4
África	1	0.2	15	0.4
Multi-continente	4	0.7	298	8.6
Total	534	100	3464	100

* Reproducido con permiso de Wiley Journal of Gene Medicine. Sitio red: http://www.wiley.co.uk/genmed

 

Tabla II. Protocolos de terapia génica por tipo de indicación*

Categoría	Protocolos		Pacientes
	Número	%	Número	%
Cáncer	333	62.4	2389	69
Enfermedades monogénicas	71	13.3	309	8.9
Enfermedades infecciosas	36	6.7	408	11.8
Enfermedades vasculares	36	6.7	59	1.7
Otras enfermedades	8	1.5	19	0.5
Marcación génica	48	9	274	7.9
Voluntarios sanos	2	0.4	6	0.2
Total	534	100	3464	100

* Reproducido con permiso de Wiley Journal of Gene Medicine. Sitio red: http://www.wiley.co.uk/genmed

PAUTAS PARA EL LOGRO DE UNA ELECTROFISIOLOGÍA CARDÍACA DE ALTO NIVEL

Raúl J. Francés

Saint Luke’s Hospital, University of Missouri, Kansas City.

(Rev Méd Rosario 67:117-118, 2001)

La Electrofisiología Cardíaca clínica ha cobrado notorio auge en las últimas dos décadas en todo el mundo. Desde que Waller registró el primer ECG en 1887 1 y Willem Einthoven publicó "A New Galvanometer" en 1903 2 para la difusión de su invento, se ha recorrido un largo camino para comprender la fisiología y patología del sistema de conducción cardíaco. El comienzo de la aplicación clínica de estos conocimientos fue la utilización del electrograma del haz de His para diagnóstico de trastornos de conducción, constituyendo una etapa sembrada de logros. El espectro de indicaciones se fue ampliando a medida que aumentaba la información sobre las arritmias cardíacas a tratar, lo que dio sucesivos impulsos a la especialidad. Así, el advenimiento de la estimulación ventricular programada para inducción de taquiarritmias ventriculares con prueba de drogas antiarrítmicas significó un avance notable. El poder elegir una droga antiarrítmica en base a la respuesta a su administración durante el estudio electrofisiológico permitió dejar de lado casi totalmente el tratamiento empírico de arritmias graves como la taquicardia ventricular. La indicación de nuevas y más efectivas medidas para tratar esta arritmia como, por ejemplo, la prescripción de un desfibrilador implantable, reside muchas veces en el resultado de la estimulación ventricular programada. La ablación de arritmias cardíacas por aplicación de radiofrecuencia dio el último gran impulso a la especialidad, que pasó de ser meramente diagnóstica o de guía terapéutica a curativa. La ablación por radiofrecuencia (ARF) nos ha permitido curar arritmias por más de una década; sus aplicaciones se han extendido con el curso del tiempo y a la luz de nuevos conocimientos, y sus resultados se han mejorado notablemente. Para quienes nos iniciamos en la Cardiología hace varias décadas, la ARF no deja de asombrarnos y entusiasmarnos. Recuerdo el primer procedimiento en el que participé hace aproximadamente 10 años; no salía del asombro al comprobar que la medicina había conseguido una técnica que terminara en unas horas con patologías que requerían tratamientos medicamentosos de por vida, muchas veces ineficientes y otras tantas acompañados de importantes efectos indeseables. Para los cardiólogos que tratábamos pacientes con arritmias cardíacas, la ARF fue el comienzo de una nueva era, la de curación de las arritmias cardíacas.

El avance de la especialidad estuvo parangonado al avance de la tecnología aplicada a esta rama de la medicina. Mejor y más moderno equipamiento posibilitó vencer nuevas fronteras. Los equipos computarizados de estimulación y registro han dado mayor precisión a nuestro trabajo, sobre todo cuando el éxito de un procedimiento reside en pequeñas diferencias en nuestras mediciones u observaciones. Los catéteres deflectables fueron cambiando, adaptándose a nuestras necesidades y requerimientos. La moderna infraestructura es un requisito básico para la eficiencia en nuestra tarea.

Por supuesto, quienes lideraron la especialidad en el mundo y lo siguen haciendo, fueron los grupos que trabajaban en países que contaban con mayor desarrollo tecnológico aplicado a la medicina y con el poder adquisitivo para hacer frente a los altos costos de la especialidad. Pero el contar con buen equipamiento es sólo un aspecto del tema. Se requiere que los riesgos a los que se somete el paciente durante un procedimiento en el Laboratorio de Electrofisiología Cardíaca sean bajos, en lo posible casi nulos, y que los beneficios sean lo suficientemente importantes para justificar un procedimiento invasivo. Ello se logró, en parte, por lo ya mencionado: equipos mejores y más seguros, equipamiento descartable de mejor calidad. Esto generó mejores resultados en nuestros laboratorios. El otro factor que permitió la obtención de mayores logros fue la capacitación del personal médico y no médico que tiene a su cargo los procedimientos. A comienzos de 1990, en países como Estados Unidos se estableció la necesidad de que los médicos cardiólogos que realizaban procedimientos en Laboratorios de Electrofisiología Cardíaca fueran entrenados para ello en hospitales o centros médicos autorizados por el organismo rector a nivel nacional de la especialidad 3. Para ser un Servicio autorizado, entre otras cosas, se requiere que el director de Electrofisiología reúna condiciones de capacitación para enseñar la especialidad a uno o más colegas y que el número de procedimientos sea lo suficientemente importante para que el médico en entrenamiento adquiera la experiencia necesaria para luego poder realizarlos por sí mismo. Incluso está establecido el número de procedimientos que debe haber realizado al finalizar el entrenamiento. Así por ejemplo, la ciudad de Kansas City (EE.UU.) tiene cuatro servicios de Electrofisiología Cardíaca, pero sólo uno de ellos está acreditado para tener médicos en entrenamiento en esta especialidad dado que reúne los requisitos establecidos 4. El tiempo que dura el aprendizaje fue considerado uno de los aspectos relevantes del mismo. Aquellos cardiólogos que son especialistas en Electrofisiología y Marcapasos han realizado, al menos, dos años de entrenamiento en la especialidad, participando activamente en cada procedimiento, y muchos de ellos se han sometido a un exhaustivo examen para lograr su certificación. El entrenamiento no es simple, ya que el entrenador tiene que garantizar que su dirigido reúne las condiciones exigidas en cuanto a experiencia y capacitación para los procedimientos a realizar. Es decir, la legislación médica es estricta para dar, por un lado, garantías a los pacientes y por el otro, mantener la excelencia en la especialidad. Obviamente, los organismos rectores en medicina evitaron, de esta forma, que médicos sin o con poca capacitación realizaran estudios invasivos por el riesgo que ello significaba y los resultados que traería aparejado. ¿Y quiénes más interesados que los mismos electrofisiólogos en que esto sea así? Malos resultados redundarían en el descrédito de la especialidad y de quienes la ejercen.

En los países como el nuestro donde la Electrofisiología Cardíaca está en franca expansión, al igual que lo ocurrido con la hemodinamia en su momento, éste es un punto crucial para lograr mayor difusión de la misma entre los profesionales de la salud y la población. Debemos mostrar resultados de eficiencia. Como en toda disciplina médica, se requiere capacitación y más aún tratándose de una especialidad intervencionista. Capacitación y eficiencia están directamente relacionadas. Inducir taquiarritmias, por ejemplo, implica tener la suficiente experiencia para detener la arritmia por los distintos medios con que se cuenta y contar con el equipamiento necesario para realizar ese procedimiento. Una aplicación de radiofrecuencia genera lesión que, aunque pequeña, no es despreciable, por lo que las técnicas de mapeo deben ser lo más precisas posible para evitar injurias innecesarias y daño al sistema de conducción normal. Realizar actualmente un estudio electrofisiológico fuera de un laboratorio de electrofisiología, con infraestructura insuficiente o utilizando técnicas en desuso, para meramente satisfacer la curiosidad de conocer el período refractario de una vía anómala, por ejemplo, es una irresponsabilidad inadmisible y no le hace bien ni a la Electrofisiología ni a los electrofisiólogos, ni brinda beneficio a los pacientes. Se deberían evaluar los centros de capacitación y atención existentes actualmente en Argentina y establecerse como únicos acreditados a los que reúnan los requisitos necesarios, tanto en lo que a infraestructura se refiere como a capacitación del personal que allí trabaja. Debemos cuidar al paciente y a la especialidad. Deberíamos establecer las bases para programas de entrenamiento para todos aquellos cardiólogos que quieran ser electrofisiólogos. Esta nueva organización y acreditación en la especialidad no debería provenir solamente de los mismos electrofisiólogos, para evitar suspicacias o amiguismos. Debería nacer de nuestras instituciones y asociaciones que regulan la práctica de la medicina.

No he mencionado deliberadamente cifras de éxito o fracaso de un procedimiento ablativo, ya que es de poco valor informativo una estadística extranjera para el cardiólogo argentino que derivará a su paciente para ARF a un Servicio de nuestro país y no de Europa o Estados Unidos. Lamentablemente, no contamos con estadísticas propias, comparativas, multicéntricas, que nos sirvan de referencia y nos permitan saber si nuestros resultados son adecuados.

Por lo dicho en los párrafos anteriores el lector concluirá que, a consideración de quien suscribe, los riesgos y beneficios de la Electrofisiología Cardíaca dependen fundamentalmente de la capacitación y habilidad del electrofisiólogo y de la infraestructura con la que cuenta, y ello es evidentemente variable. Habría que referirse probablemente, en esta primera etapa, a riesgos y beneficios del electrofisiólogo más que de la Electrofisiología.

Finalmente, quiero rescatar a aquellos colegas que han realizado enormes esfuerzos para capacitarse, lo han logrado y están actualmente trabajando en nuestro país con todas las dificultades que conocemos pero con la misma seriedad y eficiencia con que se realiza en el extranjero. En ellos reside la esperanza de una Electrofisiología argentina de alto nivel.

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DOCTOR JUAN JOSÉ STAFFIERI

Dra. Débora Kirilovsky

(Rev Méd Rosario 67:125-127, 2001)

En cuanto surge el nombre del doctor Juan José Staffieri, sus colegas discípulos rápidamente expresan el afecto y el enorme respeto que despertó en ellos. Sin duda este médico rosarino pionero de la endocrinología de su ciudad y en la Argentina, hizo mucho para que se lo recuerde de esta manera. Y todo lo realizó en el transcurso de sus 47 años de vida. Parece un lapso demasiado corto para tantos logros.

Los años de formación

Lo cierto es que fue un alumno destacado que acumulaba medallas de oro y que consideraba sus logros como el producto de "herencia, educación y medios", como solía decir, junto a una voluntad de trabajo que no conoció desmayos. Fue el hijo excepcional de un padre excepcional, el Profesor doctor David Staffieri, otro gran exponente de la medicina de Rosario.

Juan José Staffieri logró su título de médico en Rosario en 1945, luego de lo cual se trasladó a Buenos Aires donde hizo su entrenamiento en Endocrinología junto a quien fue su maestro, el doctor Enrique del Castillo, en el Hospital Rivadavia. Allí obtuvo su doctorado en 1946 con una tesis titulada "El tiouracilo. Estudio clínico sobre su empleo para el tratamiento del hipertiroidismo". Con su doctorado en mano, regresó a Rosario y fue, durante 25 años, el más trabajador y entusiasta referente del desarrollo de la Endocrinología como especialidad en esa ciudad.

Una intensa labor en Rosario

Sus comienzos en Rosario fueron complejos. Eran años intensamente politizados, que impidieron a muchos desarrollar una vida académica en las universidades nacionales. Staffieri resolvió este impedimento desarrollando una rica actividad docente y de investigación en el ámbito privado, tanto en el Hospital Italiano como en el Sanatorio Británico o en la Clínica de Enfermedades Endócrinas y de la Nutrición que fundó en 1949, junto con los doctores Luis J. Cardonnet y Pedro O. Tommasino. En dicha clínica también trabajaron sus colegas y amigos el Profesor doctor Leo Lencioni y el doctor Derio Eberhardt. Además, ese mismo año dictó el primer curso de Endocrinología en el Hospital Italiano, iniciando de esta manera la formación de discípulos.

Cuando las puertas de la Universidad volvieron a abrirse, su genio entusiasta y su increíble capacidad de trabajo, le permitieron obtener el cargo de Jefe de Trabajos Prácticos de Semiología en 1956 y en 1958, y por concurso, el de jefe del Centro de Endocrinología y Metabolismo del Hospital Nacional del Centenario, el hospital escuela. Este último había sido creado ese mismo año como resultado de las gestiones y las propuestas del propio Staffieri. Asimismo, trabajó incansablemente para la creación de la Sociedad Rosarina de Endocrinología, de la cual fue el primer presidente, y para el surgimiento de la Fundación para el Fomento de Estudios Endocrinológicos de Rosario.

Una actualización constante

Su genuino interés por el conocimiento hizo que nunca perdiera el contacto con

su maestro el doctor del Castillo, ya que a partir de su instalación en Rosario viajó mensualmente a Buenos Aires junto con sus colaboradores, para asistir a diferentes cursos y reuniones. Efectuó también viajes al exterior para perfeccionarse. Asistió a los servicios de la especialidad de los doctores De Gennes (París), Marañón (Madrid), Soffer (Nueva York), Joslin, Thorn (Boston) y Hancroft (Toronto). Fue miembro de quince sociedades científicas y su contribución al progreso de la Endocrinología le mereció reconocimiento nacional e internacional.

Sus colegas recuerdan que se levantaba todos los días a las cinco de la mañana y estudiaba dos horas. Argumentaba que si no lo hacía así luego no encontraría tiempo debido a sus múltiples ocupaciones.

Sus colegas también recuerdan con humor que solían llamarlo "mi fichero mágico" ya que redactaba fichas bibliográficas a partir de los artículos leídos y en cada una de ellas escribía un comentario. Al morir dejó un archivo de 25.000 fichas. Los médicos que trabajaron con él también señalan que era el primero en llegar al hospital, el último en irse y siempre resultaba el más activo en el trabajo cotidiano. Solía esperarlos estacionado en su coche, en la puerta del Hospital Italiano, a las 7:30, releyendo las últimas revistas de Endocrinología.

El reconocimiento

En 1965 obtuvo por concurso el cargo de Profesor Titular de Patología Médica. En esa época se iniciaron en la Facultad las gestiones tendientes a reorganizar el plan de estudios de la carrera. Las materias clínicas fueron reunidas bajo la denominación de "Departamento de Medicina Interna", y Staffieri fue elegido como director del mismo. Fue además el primer profesor de la Cátedra de Medicina Interna IV en la cual se dictó Endocrinología, Metabolismo y Reumatología.

Durante su actuación en la Facultad sus ideas fueron claras y progresistas, apoyó incondicionalmente la creación de residencias, organizó reuniones de Seminarios y coordinó la actividad docente. Preocupado siempre por los jóvenes, trabajó intensamente en la formación de becarios e investigadores del país y provenientes de países vecinos.

En 1967 se convirtió en miembro correspondiente de la Academia Nacional de Medicina. Fue presidente de la Sociedad de Endocrinología y Metabolismo y del Círculo Médico de Rosario y asimismo de la Sociedad Argentina de Endocrinología y Metabolismo.

En 1968 se inició el primer curso de Medicina Interna IV. Organizó todo desde el comienzo y estuvo presente hasta en los más mínimos detalles. En la clase inaugural pronunció emotivas palabras de agradecimiento a quienes habían sido sus maestros de la Facultad, el doctor Enrique J. Roncoroni, Profesor de Anatomía Descriptiva, el doctor Juan P. Lewis, Profesor de Fisiología, el doctor Clemente Álvarez, profesor de Clínica Médica y eldoctor Juan M. González, profesor de Patología Médica, así como para el doctor Enrique del Castillo, Jefe del Servicio de Endocrinología del Hospital Rivadavia.

Su obra formadora y fundadora se vio favorecida por su espíritu amplio y tolerante, incapaz de sectarismos, equilibrado por naturaleza e inclinado al trabajo en equipo y a la convivencia.

Sus intereses científicos

Staffieri estaba convencido de que la investigación y la divulgación de los conocimientos era fundamental para el desarrollo de la medicina dentro del país; por este motivo, desarrolló una muy importante labor en ambas áreas.

En cuanto a sus investigaciones, éstas abarcaron una amplia gama de temas dentro de la Endocrinología, tales como Tratamiento preoperatorio del hipertiroidismo con drogas antitiroideas, Cáncer de mama y función tiroidea, Laboratorio en el diagnóstico de los trastornos endocrinológicos, Hipoglucemia como manifestación de tumor suprarrenal, Relación del fondo de ojo y la diabetes, Tratamiento de la diabetes, Acciones de la clorpropamida, Síndrome de ovarios rudimentarios y Precocidad sexual, entre otros.

Respecto de la divulgación de los conocimientos, fue autor de tres libros de la especialidad: "Semiología y Clínica Propedéutica de las Glándulas Endócrinas", "Enfermedades de la corteza suprarrenal" y "Venciendo la diabetes", y fue coautor de otros tres, en los que participó incluyendo capítulos de su autoría en "Clínica Endocrinológica", en "Terapéutica Clínica" y en el "Simposio de Citología Exfoliativa sobre el embarazo normal y patológico". Perteneció, además, a los comités de redacción de revistas científicas: Medicina (Buenos Aires), Revista Argentina de Endocrinología y Metabolismo y Revista Médica de Rosario.

El mundo de sus afectos

Para este hombre incansable sólo existieron dos universos: el de su familia y el de su trabajo.

La casa paterna lo había imbuido de firmes ideales y convicciones. De su madre, decía, había heredado la capacidad de tolerancia, la firmeza y la formación de su carácter. Tuvo veneración por su padre ya que fue su constante fuente de inspiración. Este amor por su familia tuvo su natural continuación en su esposa e hijos. A ella le agradecía profundamente haber allanado, hasta la abnegación, el camino que le permitía desarrollar su vocación. Según sus propias palabras, su esposa "ha sido la solución permanente de problemas, sin jamás plantear ninguno. La considero el ideal de la esposa del médico, que debe tener tanta o más generosidad espiritual que éste, ya que muchas veces tiene que intuir más que comprender las razones de la entrega total y permanente de su compañero".

Para sus hijos fue un padre jovial, de carácter alegre pero a la vez exigente, y un poco distante a causa de su trabajo. La imagen que ellos conservan es la de su padre leyendo o escribiendo a máquina en su escritorio, con la pipa siempre cerca.

Su único descanso sobrevenía los fines de semana que pasaba en familia, en el campo o en paseos por el río, ya que era un gran aficionado a los viajes en lancha.

Una muerte prematura

La muerte, tan súbita como inesperada, llegó cuando finalizaba el primer ciclo de Medicina Interna IV. Juan José Staffieri falleció el 22 de junio de 1968 en La Cumbrecita, Córdoba.

Tres días después de su muerte, el doctor Cardonnet se hizo cargo de la Cátedra que hasta enconces había dirigido Staffieri y agradeció a los alumnos en nombre de sus colegas y familiares por su desinteresada presencia frente a la Facultad y en el sepelio. Fue un agradecimiento emotivo y justificado. Durante el paso del cortejo los alumnos habían alfombrado con sus guardapolvos la escalinata de la Facultad. Pidieron además la devolución del último examen, corregido personalmente por el profesor, para conservarlo como recuerdo.

Un mandato cumplido

En 1938 su padre, el doctor David Staffieri, en una conferencia que se tituló "El médico que hubiera querido ser" le pidió a su hijo, casi bachiller y futuro estudiante de medicina, que tuviera un poco de héroe, de santo y de sabio. Luego de la muerte de Juan José Staffieri, el doctor Cardonnet le respondió: "Quiero decirle, doctor David, que usted le pidió mucho, pero Juan José supo darle todo. Sin ninguna duda, su vida no fue una quimera sin sentido, pues vibró al compás de la madre doliente, sufrió a la par del enfermo indefenso y, además, tuvo ese mucho de estudioso que usted le requirió y ese poco de santo que sólo los grandes pueden tener".

Al morir dejó en sus colegas y discípulos una honda sensación de pesar y como escribió Houssay en la nota que envió con motivo de la recordación del primer aniversario de su muerte: "Perdimos una personalidad excepcional pero los discípulos que formó y las obras que inició o desarrolló, así como su ejemplo, prolongarán su vida ejemplar. El vacío que dejó no se llenará fácilmente, pero debemos apoyar su obra". Que así sea.

 

Nota de la autora:

Agradezco a los Profesores doctores Leo J. Lencioni, Derio R. Eberhardt, Luis J. Cardonnet y Julio Libman su amable disposición para compartir recuerdos y experiencias, así como el hermoso material escrito tan generosamente brindado. Al doctor Juan José Staffieri (h), el relato abierto y afectuoso de sus conmovedoras vivencias.

Homenaje al maestro

Profesor Dr. Julio Libman

Es para mí un honor y un compromiso íntimo realizar una semblanza de alguien que, como dijera el Profesor Houssay, obtuvo su condición de maestro por la labor realizada a lo largo de toda su vida. Recordar al profesor Juan José Staffieri es volver a imágenes y sensaciones relacionadas con una persona que se ha querido y respetado.

Fue, sin duda, uno de los pilares fundamentales del desarrollo de la Endocrinología en Rosario. Durante su formación fue uno de los mejores promedios tanto en el ciclo primario y secundario como en el universitario. Habiéndose graduado de Médico Cirujano y Doctor en Medicina en la Universidad Nacional del Litoral, se convirtió en un hacedor del oficio que es la Medicina, a través de la transmisión de conocimientos en el área docente, asistencial, de investigación y de gestión institucional. Como docente, fue un verdadero maestro. Enseñaba con su saber y con el ejemplo, con su proceder honesto, con la rigurosidad de sus apreciaciones, siempre asumiendo la responsabilidad de transmitir a las generaciones futuras los conocimientos que él había recibido oportunamente. Fue el impulsor de la enseñanza en Endocrinología como materia de grado en la carrera de Medicina.

Su formación humanística, su sencillez y su sentido de humildad lo llevaron a desarrollar tareas asistenciales en las que cada paciente era tratado como un ser único, respetando su identidad, a la vez que hizo partícipe de ese pensamiento y proceder a sus colaboradores y discípulos.

Su inteligencia, su capacidad de observación y su deseo de indagar en lo desconocido, lo llevaron a realizar investigaciones en diferentes líneas dentro de la Endocrinología y a estimular en los jóvenes el interés por la misma. En ese sentido, él fue el inspirador y propulsor de la beca que obtuve del Instituto Nacional de la Salud de los Estados Unidos, a partir de la cual inicié mi trabajo en el área.

De su gran compromiso con la medicina y con la vida, surge su obra en la gestión institucional. Nada le resultaba superficial o banal, se comprometía y profundizaba en todos los aspectos de su gestión, anticipándose a los problemas y necesidades que pudieran surgir.

Fue el creador de la Fundación para el Fomento de Estudios Endocrinológicos, donde manifestó en todo momento una coherencia entre su pensamiento y su acción. Participó y dirigió además todas las instituciones locales y nacionales de la especialidad, a fuerza de trabajo tesonero y constancia. De esta manera, contribuyó a la formación de equipos de especialistas que trabajaron con libertad y en los que convivió la diversidad y que afortunadamente lo trascendieron.

Sus logros son un símbolo del equilibrio entre el conocimiento, el amor, la esperanza y la acción. Sus pensamientos y sus ideas han quedado en sus obras, pero su fuerza y su calidad humana han sido semillas que han ido dando frutos dentro de su familia, entre sus colaboradores y entre aquéllos que tuvimos el privilegio de ser sus discípulos.

TRIQUINOSIS: Presentación de 60 casos.

C. VERA*, G. GAUDENCIO*, S. PARDINI*, V. SEQUEIRA**, E. BAIGORRI***
Servicio de Guardia, Hospital Escuela Eva Perón, Granadero Baigorria (SF).

(Rev Méd Rosario 67:73-75, 2001)

Resumen

En 60 pacientes que consultaron en el Servicio de Guardia desde el 18 de agosto hasta el 10 de octubre de 2000, se evaluaron la expresión clínica y datos de laboratorio en relación con un foco identificado en la zona. La edad osciló entre 3 y 74 años. Se solicitó hemograma, CPK, test de IFI y ECG. El diagnóstico de ingreso se realizó por la presencia de noción de foco epidemiológico concluyente y sintomatología característica en el 77% de los pacientes. Los pacientes recibieron mebendazol 5 mg/kg cada 12 hs. durante 10 días (n= 48), o albendazol 400 mg cada 12 hs. durante 6 días (n= 12). A un pequeño número de pacientes se les agregó corticoides por mialgias intensas, con excelentes respuestas. No hubo complicaciones severas en ningún caso. Conclusión: en nuestra experiencia, la clínica y la noción de foco epidemiológico fueron concluyentes para dar inicio al tratamiento. La prevención, educando a la población en el consumo de productos debidamente controlados, es de fundamental importancia.

Summary

TRICHINOSIS: PRESENTATION IN 60 CASES.

Sixty patients with trichinosis were seen in the Emergency Room from August 18^th to October 10^th, 2000, in relation to a focus identified in the area covered by the Teaching Hospital "Eva Perón", in Granadero Baigorria, Province of Santa Fe, Argentina. Ages ranged between 3 and 74 years. Complete blood counts, serum creatin-phosphokinase and indirect immunofluorescence were ordered. High-risk patients had ECGs performed. Diagnosis was made on the basis of a known epidemiological focus and characteristic symptoms and signs in 77% of the cases. Fourty-eight patients received mebendazole, 5 mg/kg BID during 10 days, while 12 patients were treated with albendazole, 400 mg BID during 6 days. A small number of patients required corticosteroids due to severe muscle pain, with excellent therapeutic response. No serious complications were seen. In conclusion, clinical presentation and knowledge about the epidemiological outbreak were critical for early treatment. Prevention is extremely important: public education stressing the convenience of consuming only controlled foodstuffs should be permanent.

 

Introducción

La triquinosis se desarrolla cuando se come carne poco cocida contaminada con larvas infectantes de Trichinella spiralis. La mayoría de las infecciones son asintomáticas, pero la exposición importante puede conducir a la aparición de diarrea, edema periorbitario, miositis, fiebre y postración. Ciclo vital: entre los Nematelmintos, gusanos cilíndricos con cuerpo no segmentado, sin miembros articulados y recubiertos de un tegumento quitinoso, se encuentra la familia Trichinellidae, que a su vez tiene tres géneros: Trichinella, Trichiuris y Hepaticola. Trichinella tiene una sola especie, que es Trichinella spiralis, parásito de los mamíferos, especialmente de los carnívoros y/u omnívoros.

Trichinella spiralis se caracteriza por su dimorfismo sexual, donde la hembra adulta tiene de 3 a 4 mm de largo y 0.6 μm de ancho y el macho 1.5 mm y menos ancho.

Cuando se come carne que contiene larvas de Trichinella spiralis, los microorganismos son liberados de las paredes del quiste por la digestión ácido-péptica en el estómago y pasan al intestino delgado, fijándose a la mucosa en las bases de las vellosidades; se desarrrollan hasta llegar a gusano adulto.

Cada hembra fertilizada libera alrededor de 500 a 1000 larvas en 2 semanas y luego es eliminada por las heces. Las larvas recién nacidas pasan al torrente sanguíneo y siembran los musculos esqueléticos. Se introducen en las fibras musculares y luego en tres semanas aumentan 10 veces su longitud y se enrollan. Se desarrolla una pared quística alrededor de la larva, que puede eventualmente calcificarse. Las larvas se pueden mantener viables durante varios años.

La triquinosis se encuentra distribuida en todo el mundo, excepto Australia y algunas islas del Pacífico. Entre los animales carnívoros se halla ampliamente diseminada, constituyendo el ser humano un huésped accidental. La triquinosis es fundamentalmente una zooparasitosis y el humano se infecta al ingerir carnes insuficientemente cocinadas.

El ciclo parasitario se mantiene entre animales carnívoros, omnívoros y también otros que, como las ratas, suelen comer carroña. Es muy interesante y conocido el ciclo silvestre o semidoméstico de ratas-cerdos y cerdos alimentados con desperdicios en basurales.

Triquinella spiralis ha sido encontrada en músculos de osos (incluso polares), en focas, jabalíes, pecaríes, perros, gatos y varias clases de roedores, de manera que la zooendemia está muy extendida en el mundo.

Manifestaciones clínicas. En el hombre el cuadro clínico de triquinosis se puede dividir en cuatro períodos bien definidos.

Período de incubación: es el tiempo que transcurre desde el momento de la ingestión de la comida infectante y la aparición de las manifestaciones clínicas. Es un período asintomático que oscila entre 48 horas y 30 días (tiempo medio de 1 a 2 semanas); esta variable depende del número de larvas viables que se ingieren, lo cual guarda relación con la magnitud de la infección que presenta el porcino, el volumen de carne ingerida y el grado de cocción y de estacionamiento de la misma.

Período de invasión: comprende a las fases intestinal y hemática del ciclo parasitario; sería la primer semana. Se inicia con un sindrome constituido por fiebre (38/39ºC), cefaleas, astenia, adinamia y sudoración. Se pueden asociar a estos síntomas, inespecíficos, otros de naturaleza gastrointestinal como náuseas, vómitos y cólicos, a veces diarreas líquidas o semilíquidas, que se deben a la excitación del peristaltismo por la penetracioón submucosa de las hembras para efectuar embrioparición. Los signos más característicos de este período se encuentran en el extremo cefálico, con edema de los párpados e irritación conjuntival. Al examen físico se observa rostro tumefacto y a la palpación se aprecian edemas ligeros en sienes y mejillas y otros más intensos e indoloros que abarcan a los párpados en forma bilateral, principalmente en el ángulo externo del ojo, que provoca sensación de cuerpo extraño. En sangre aparece al final de la 1ª. semana leucocitosis con eosinofilia persistente y variable, generalmente alta (signo de Brown); esta eosinofilia tiene gran importancia tanto para el diagnóstico de los casos subclínicos como para seguir la evolución del paciente. Cabe aclarar que en algunos casos esto puede faltar.

Período de estado: corresponde a la generalización de las larvas en el organismo y a la invasión muscular. La fisiopatología del edema y de los dolores musculares se asocia con la vasculitis e infiltraciones perivasculares que favorecen la salida de agua al espacio intersticial y a la infiltración de los músculos esqueléticos, donde se desarrolla el proceso inflamatorio. El síntoma más importante en este período son los dolores musculares, espontáneos y a la presión; son principalmente afectados los músculos lumbares, de miembros inferiores y respiratorios. En este período pueden presentarse síntomas cardíacos y meningoencefálicos que ensombrecen el pronóstico. La miocarditis es infiltrativa y eosinofílica, no constatándose la presencia de larvas (cuadro de miocardiopatía aguda). Lleva a dolor precordial tipo anginoso y palpitaciones.

Período de convalescencia.

Laboratorio. La intensa miositis está denunciada por las elevaciones manifiestas y significativas de miocinasa, lacticodeshidrogenasa, creatinfosfoquinasa (CPK) y transaminasas (TGO y TGP), con eritrosedimentación normal o baja.

Diagnóstico serológico. En la actualidad se emplea la inmunofluorescencia indirecta (IFI, con una sensibilidad del 99% y una especificidad del 98%). Indica infección cuando se detecta una concentración de anticuerpos circulantes iguales o mayores a 1/128.

Prevención. El modo más efectivo para producir la destrucción de las larvas de Trichinella es por medio de la cocción adecuada de la carne; el punto térmico de muerte es de 55/57ºC, de modo que la carne debe cocerse hasta que no existan restos líquidos o color rosado. El almacenamiento en congeladores familiares (-15ºC) durante 3 semanas habitualmente esteriliza la carne. No se aconseja el ahumado, el salado o la desecación.

Objetivos

Evaluar en un grupo de 60 pacientes que consultan en el servicio de guardia durante casi 2 meses (18/VIII-10/X/2000) la expresión clínica y los datos de laboratorio en relación con un foco identificado en la zona.

Material y métodos

Las consultas correspondientes a 60 pacientes fueron efectuadas en el servicio de guardia entre la primera y tercera semana. La edad osciló entre 3 y 74 años. Se solicitó hemograma (recuento de leucocitos con fórmula), CPK (rango de referencia: 0-130 U/ml), IFI, y electrocardiograma (ECG). El seguimiento se realizó en consultorio externo por personal de guardia y de clínica médica.

Resultados

De 60 pacientes, hubo 50 adultos (29 hombres y 21 mujeres) y 10 niños (5 varones y 5 mujeres). Las edades oscilaron entre los 3 y 74 años.

La incidencia de los síntomas y su prevalencia fue:

Frecuentes:

Mialgias 69%
Edema bipalpebral 43%
Fiebre 42%
Diarrea 20%

Poco frecuentes (<20%):

Astenia
Decaimiento
Náuseas
Cefaleas y mareos
Hipo-orexia
Dolor abdominal

Los hallazgos del laboratorio fueron:

CPK en un rango de 166 a 4080. Eosinofilia en un rango de 5 a 25%. Leucocitosis en 65% de los casos. IFI: 20% de positivos en la primera muestra, 60% en la segunda, y 100% en la tercera.

Se realizó ECG en el 30% de los pacientes, siendo éstos mayores de 40 años y con factores de riesgo. Los patrones hallados fueron normales excepto en 1 caso que mostró trastorno de la repolarización.

La mayoría de los pacientes recibieron mebendazol 5 mg/kg cada 12 hs. durante 10 días, y algunos recibieron albendazol 400 mg cada 12 hs. durante 6 días. A un pequeño porcentaje de pacientes se le agregó corticoides por mialgias intensas, obteniéndose excelentes respuestas. No hubo complicaciones severas en ningún caso.

El diagnóstico de ingreso se realizó por la existencia de noción de foco epidemiológico concluyente, por la sintomatología característica, presente en el 77% de los pacientes, la presencia de eosinofilia y CPK elevada, que se presentaron en el 40% del total de los individuos con triquinosis. Se completó el diagnóstico con la realización de IFI, que fue positiva en la primera muestra sólo en el 20% de los pacientes.

Bromatología realizó el examen triquinoscópico de los productos consumidos, siendo todos positivos. El SENASA se encargó de la identificación de los animales.

Discusión

En nuestra experiencia, la clínica y la noción de foco epidemiológico fueron concluyentes para dar inicio al tratamiento. La eosinofilia y la CPK se encontraron elevadas sólo en el 40% de los pacientes; asimismo la IFI, que fue positiva en la primer semana sólo en el 20% de los casos; en el resto se positivizó a partir de la tercera semana de infección. No se realizó biopsia muscular en ningún caso.

El tratamiento realizado demostró excelentes resultados, con muy buena tolerancia oral y sin presentar signos y síntomas de reacciones adversas a los fámacos durante el control y seguimiento de los pacientes.

La mayoría de los enfermos que se reportan en este trabajo pertenecen a un sector socioeconómico de bajos recursos, en el cual es común el consumo de productos caseros.

Debemos enfatizar la prevención, educando a la población en la compra de productos debidamente controlados y desaconsejando la ingesta de productos caseros o poco cocidos. La prevención debe hacerse no sólo desde los establecimientos sanitarios y educacionales: también le corresponde a las autoridades encargadas del control e identificación de establecimientos autorizados y no autorizados para el faenamiento, producción y elaboración de chacinados y embutidos.

Bibliografía

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Cátedra de Enfermedades Infecciosas, Hospital Provincial del Centenario: Triquinelosis. Rosario, 1997.

SENASA. Datos bromatológicos, 2° período del año 2000.