APRENDIENDO DE UN INCIDENTE OLVIDADO: EL EPISODIO DE AZUL

Stella Maris Martínez

1) Coordinadora de la Comisión de Bioética de la Facultad de Ciencias Médicas de la UNR

Resumen

A mediado de los ochenta, el Instituto Wistar de los Estados Unidos llevó a cabo en Azul, provincia de Buenos Aires, el primer ensayo a campo de un virus vaccinia al que por ingeniería genética se había insertado ADN de virus rábico. Aunque se trataba de una investigación en los albores de los estudios con agentes recombinantes y el virus modificado podía ser peligroso para las personas y el ecosistema, no se informó ni pidió autorización al gobierno argentino. En un campo experimental dependiente de la Organización Panamericana de la Salud, se inocularon 20 vacas con el virus vaccinia-rabia para probar su capacidad inmunizante contra la rabia bovina. Enterado el gobierno argentino gracias a la información brindada por un investigador argentino de Wistar, ordenó investigaciones en la zona que culminaron con la rápida interrupción del experimento. Algunos de los trabajadores agrícolas en contacto con los animales se habían infectado y la leche ordeñada, conteniendo partículas virales, se había vendido a la comunidad. El episodio de Azul, olvidado en la Argentina, fue una grave violación de principios éticos y de seguridad sanitaria. Pudo realizarse al amparo del secreto y de la falta de controles efectivos. Nos enseña la necesidad de marcos regulatorios claros para la investigación científica en todos los países, particularmente en los del Tercer Mundo, que son los más desprotegidos. Los problemas que genera la revolución biotecnológica impulsa la búsqueda bioética de límites que deben respetar quienes conducen la investigación biomédica.

Palabras clave: ensayo a campo de Azul; Bioética; investigación biomédica; países del Tercer Mundo; marcos regulatorios

LEARNING FROM A FORGOTTEN INCIDENT: THE AZUL AFFAIR

Summary

In the eighties, the Wistar Institute of the United States carried out the first field trial of a vaccinia virus in which rabies virus ADN had been inserted by genetic engineering. The trial was made in Azul (Province of Buenos Aires), Argentina. Although it was a pioneering investigation, in the wake of recombinant live agents, and there were potential dangers for humans and the ecosystem, the Argentine government received no previous information, nor was permission requested. In an experimental field owned by the Panamerican Health Organization, 20 cows were inoculated with the rabies-vaccinia virus in order to determine its immunizing capacity against bovine rabies. The Argentine government, alerted by an Argentine investigator working for Wistar, ordered investigations in the area that led to a rapid interruption of the experiment. Some of the rural workers in contact with inoculated animals had been infected, and the collected milk, containing viral particles, had been sold to the local community. The Azul affair, now forgotten in Argentina, was a serious violation of ethical principles and sanitary safety procedures. It was possible under the cover of secrecy and lack of effective regulatory controls. The episode illustrates about the need of clear regulatory frameworks for scientific investigation in all countries, particularly those of the Third World, which are less protected. The problems caused by the biotechnological revolution should further the ethical enactment of mandatory limitations for those involved in biomedical research.

Key words: field trial in Azul; bioethics; biomedical research; Third World countries; regulatory laws

"Necesitamos de una Ética de la Tierra, de una Ética de la Vida Salvaje, de una Ética de Población, de una Ética de Consumo, de una Ética Urbana, de una Ética Internacional, de una Ética Geriátrica, etcétera. Todos estos problemas requieren acciones basadas en valores y en hechos biológicos. Todos ellos incluyen la Bioética y la supervivencia del ecosistema total constituye la prueba del valor del sistema."

van Rensselaer Potter

Vivimos una revolución biotecnológica que impregna nuestras vidas. Las investigaciones biomédicas se desarrollan aceleradamente y emplean enormes recursos económicos. Aunque se pueda esperar mucho en términos de mejor calidad de vida para un mayor número de personas, crece la impresión de que es necesario que se regulen y controlen seriamente las prácticas experimentales a fin de preservar los derechos de las personas y de los ecosistemas, especialmente en los países poco desarrollados.

 

Un poco de historia: el episodio de Azul

En 1986 se desarrolló en Azul, departamento de la provincia de Buenos Aires, Argentina, una investigación en la que estuvieron involucrados la Organización Panamericana de la Salud (OPS) a través del Centro Panamericano de Zoonosis de Argentina (CEPANZO) y el prestigioso Instituto Wistar de Filadelfia, el más antiguo en investigación biomédica de Estados Unidos.

El objetivo fue probar, en un ensayo a campo, la efectividad contra la rabia de una vacuna recombinante a virus activo genéticamente modificado, que se llamó vaccinia-rabia.

Vaccinia-rabia fue fabricado por los laboratorios Mérieux de Francia y por el instituto Wistar.1 Mediante técnicas de clonado y secuenciación de ADN, se identificaron los genes que codifican las proteínas estructurales del virus rábico y se logró insertar el gen que codificaba una glucoproteina viral en el virus vaccinia. Se decidió probar su efectividad inmunizante sin inactivarlo para aprovechar su potencial multiplicación en sujetos susceptibles. Tenía la ventaja de hacer factible su distribución en cebos que pudiesen ser consumidos por animales silvestres, y así inmunizarlos contra la rabia. Aun sabiendo que el virus variólico modificado era un agente exótico potencialmente peligroso, máxime cuando se estaba en los inicios de la investigación de transgénicos, se decidió probarlo a campo en Argentina sin pedir autorización al Servicio Nacional de Sanidad Animal de este país.1

El diseño experimental utilizado en Azul fue sencillo. Se inoculó a veinte vacas lecheras con vaccinia-rabia y a otras tantas con vaccinia. En ambos casos existieron controles sin inmunizar. Sin ellos saberlo, un grupo de trabajadores rurales fueron parte del experimento. Cuatro cuidaban de las vacas inoculadas con vaccinia-rabia y al ordeñarlas se sometieron directamente al contagio por contacto con las pústulas de la viruela bovina. Otro grupo ordeñó las vacas infectadas con vaccinia, aparentemente con el objeto de que se pudiesen comparar la virulencia y la contagiosidad en el ser humano del virus vaccinia-rabia con el vaccinia. Estos resultados serían analizados con los obtenidos en las personas a cargo de las vacas no inoculadas. Si los animales desarrollaban anticuerpos contra la rabia, se las inocularía con una dosis letal del virus rábico para averiguar el grado de protección. Aunque se pensaba analizar las muestras de sangre de hombres y animales, vale aclarar que los responsables del estudio no realizaron ningún control médico de las personas involucradas.

Además de evaluar la eficacia de vaccinia-rabia para proteger al ganado contra la rabia bovina, el experimento permitiría medir la contagiosidad del nuevo virus al poner en contacto animales inoculados y no inoculados; comparar estos resultados con los obtenidos en el grupo de vacas inoculadas con vaccinia; investigar en el hombre el grado de virulencia y de contagiosidad de vaccinia-rabia en relación con vaccinia y observar, en general, su comportamiento en el ecosistema.

El escándalo

El experimento se llevó adelante en secreto. El virus modificado llegó a Argentina en maleta diplomática. No se avisó sobre el mismo al gobierno argentino, al Servicio de Sanidad Animal (SENASA) ni a ninguna repartición oficial. Aparentemente, tampoco la OPS había sido notificada. Su representante oficial en la Argentina dijo desconocer lo de Azul. Los peones ignoraban la índole del experimento en el que participaban y sus posibles peligros. Ningún Comité de Bioética argentino examinó el protocolo. No existió fórmula de consentimiento informado.

El experimento iba a durar de julio a diciembre de 1986 pero el secreto fue develado en septiembre cuando un investigador argentino que trabajaba en Wistar, enterado y preocupado por las consecuencias de lo que se estaba haciendo en su país, lo hizo público. Como consecuencia directa fue despedido de su trabajo.

El gobierno argentino inició la investigación. La comisión oficial que inspeccionó la zona, integrada por científicos y técnicos del CONICET (Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas) y de la Secretaría de Salud Pública, informó que las condiciones de descuido imperantes en el lugar eran alarmantes. Las experiencias se habían realizado en sitios abiertos donde ratas, perros, zorros, conejos y otros animales silvestres y domésticos tuvieron amplias oportunidades de contacto con las vacas infectadas y, por lo tanto, con el nuevo virus. Se había permitido que los peones consumieran la leche ordeñada y que vendiesen el excedente en la ciudad de Azul.

La Secretaría de Agricultura y Ganadería y el Ministerio de Salud y Acción Social argentinos suspendieron el experimento de inmediato y resolvieron brindar protección sanitaria a las personas involucradas. Cabe puntualizar que tres de los cuatro peones encargados de las vacas inoculadas con vaccinia-rabia desarrollaron anticuerpos contra la rabia como consecuencia de su contacto con los animales inoculados. Tres meses después de iniciado el experimento y tres antes de lo previsto en los protocolos, las vacas fueron sacrificadas previa toma de muestras de sangre y tejidos para análisis y estudio.

Ante el escándalo hecho público por la prensa nacional e internacional,2-4 las autoridades del CEPANZO adujeron la existencia de convenios generales entre la OPS y la Argentina que, en su opinión, servían de marco legal para la experiencia. Hilary Koprowski, responsable de la investigación por el instituto Wistar, afirmó que el experimento no había sido secreto, que no se habían entendido las motivaciones del mismo, que se había llevado a cabo en Argentina no para eludir las regulaciones existentes en Estados Unidos sino para ayudar a aquel país en donde la rabia bovina era un grave problema económico.5

Wistar afirmó que se habían limitado a proveer la vacuna a la OPS para que llevara a cabo la experiencia insistiendo en que estudios previos habían probado que la vacuna era segura y efectiva. Sin embargo, dos años después Koprowski se refería a la vacunas vaccinia-rabia glicoproteína como "la más promisoria" pero admitía que todavía se ignoraban muchos aspectos de la patogénesis de los virus rábicos.6 De hecho, el primer ensayo a campo con vaccinia-rabia recién se realizó en octubre de 1987 en Bélgica, en una zona militar perfectamente delimitada de 6 km2, y consistió en dejar cebos con el nuevo virus para probar su efecto inmunizante por vía oral en animales silvestres 7y sólo se llevó adelante a gran escala en 1988.8 En Estados Unidos, la primera prueba a campo se efectuó, en condiciones limitadas, en agosto de 1990, después de 10 años de cuidadosos estudios de laboratorio.9 Aun en la actualidad, cuando la vacuna se usa ampliamente tanto en los Estados Unidos como en Europa para el control de la rabia silvestre, se señala que es posible que, accidentalmente, afecte a embarazadas y personas inmunodeprimidas.10

Otro oscuro aspecto a destacar del episodio de Azul es la ventaja económica que significaba para Wistar llevar adelante la investigación en Argentina. Aunque desde 1980 había recibido del Ministerio de Salud de Estados Unidos 3 millones de dólares para investigar vacunas contra la rabia, Wistar invirtió poco dinero en Azul ya que se pensaba emplear, y de hecho así se hizo, las instalaciones y recursos del CEPANZO.11 Irónicamente, éste fue un argumento a su favor ya que el gobierno de Estados Unidos resolvió que Wistar no había quebrantado las normas vigentes respecto a biotecnología porque en el experimento de azul no se habían utilizado fondos federales.12 Wistar sacó provecho de que Argentina carecía de regulaciones respecto de la industria biotecnológica y que las normas legales de Estados Unidos al respecto 13 no eran aplicables en el país. Subsiste la pregunta ¿es ético que los investigadores eludan las regulaciones de Estados Unidos y realicen sus experiencias donde las regulaciones sean menos exigentes, "particularmente en países del Tercer Mundo"?14

El Servicio de Sanidad Animal argentino afirmó que el perjuicio real que causaba la rabia bovina en Argentina no era tan importante y que en Estados Unidos también existía la rabia bovina, pero que en este país estaban prohibidas experiencias de este tipo por el riesgo potencial de contaminación en seres humanos y animales. El revuelo internacional fue considerable. Bernard Dixon señaló que durante la First International Conference on the Release of Genetically Engineered Microorganisms realizada en Cardiff en 1988, se insistió en la urgente necesidad de que existiera una regulación internacional eficiente ya que el "polémico episodio argentino" de Azul, era un claro ejemplo de las "extrañas consecuencias" de la falta de regulaciones o de la asimetría de la legislación entre países.15

Como protesta, el SENASA suspendió el pago de una cuota anual de cuatrocientos mil dólares que hacía anualmente al CEPANZO, que concluyó sus actividades en 1991. Lamentablemente, las investigaciones oficiales emprendidas en momentos en que Argentina atravesaba graves conflictos económicos y sociales, no fueron concluidas y el caso se archivó sin que los responsables locales se arrepintieran públicamente ni fueran legalmente sancionados.16

Algunas reflexiones

Desde el punto de vista privado, existieron graves transgresiones éticas en el episodio de Azul. No se respetó la integridad ni la autonomía de los peones y sus familias, y nada se hizo por prevenirlos de posibles daños. Por el contrario, se los expuso al peligro en forma deliberada. Desde el punto de vista público, es obvio que la utilidad o las ventajas que podían reportarle al país eran insignificantes frente al riesgo real –y la extrema gravedad de las consecuencias posibles– de exponer las mejores tierras agro-ganaderas y a sus habitantes a un virus genéticamente alterado.

El episodio, olvidado en Argentina, es emblemático de la vulnerabilidad de los países "en vías de desarrollo". Carentes de claras orientaciones de control respecto de la investigación nacional e internacional, suelen ser víctimas del relativismo moral de quienes patrocinan en ellos investigaciones inaceptables en sus propios países. En el Tercer Mundo a menudo priman los intereses corporativos transnacionales sobre los de la población, y el Estado no es capaz de ejercer controles eficaces y responsables.

Tampoco suele existir una masa crítica de investigadores y académicos con un decidido sentido de identidad, conscientes de sus responsabilidades para con sus conciudadanos, capaces de oponerse al traslado automático de las prioridades de los países desarrollados. Al respecto es necesario rescatar la carta, publicada durante la crisis por la prestigiosa revista Nature, firmada por más de 100 científicos argentinos que protestaban firmemente por el experimento de Azul.17

¿Cómo promover la construcción de consensos de respeto por la integridad y los derechos de los seres humanos basados en la responsabilidad y en la solidaridad? Entraña graves dificultades luego de mucho tiempo de separación y fragmentación de los campos disciplinares debido a la creciente especialización del conocimiento.

En los países poco desarrollados no suelen abundar los medios de divulgación masivos que, sin conflicto de intereses, ayuden a los ciudadanos a controlar lo que se hace con su salud y el medio ambiente. Éste es un factor importante ya que se ha dicho que es imprescindible la información y la reflexión para que el agravio se vuelva visible al individuo común, cause indignación y la población ejerza sus derechos; la reflexión de los investigadores para que reconozcan sus límites y el robustecimiento de los mecanismos de control independientes para alcanzar el "Estado responsable". Siguiendo a Potter, la indignación moral pide medidas preventivas, la presión moral unida a la información genera directivas bioéticas y éstas se convierten en sanciones legales.18 Pero la apropiación de nuevos valores por parte de las personas sólo es posible en un marco general de libertad lejos de imposiciones y restricciones ideológicas. En consecuencia, la participación ciudadana y la deliberación democrática, imprescindibles para que las personas ejerzan su derecho a un efectivo control local de las investigaciones organizadas por empresas, particularmente multinacionales, será el resultado de un proceso largo y difícil.

Uno de los desafíos de la Bioética actual es ayudar a acordar los límites que deberán respetar aquellos intereses que pujan por llevar adelante experimentos biomédicos en los países más débiles sin miramientos de ninguna índole.19, 20 Los responsables de una investigación biomédica están obligados a considerar las consecuencias a corto y a largo plazo de las acciones que —por acción u omisión- recomiendan o dejan de considerar. Esta obligación se extiende a aquellas personas que deben velar por la seguridad de todos. Steven Brint ha señalado los cambios profundos que han tenido lugar en las últimas décadas en las actitudes profesionales. Puntualiza que a principios del siglo XX, el status profesional era definido tanto por un conocimiento especializado como por un sentido de responsabilidad ética y pública. Brint concluyó: "Hoy en día, los profesionales se definen cada vez más a sí mismos estrictamente en términos de su dominio de las materias técnicas, por sus habilidades y conocimientos comerciales, mientras se muestran relativamente escépticos sobre las seguridades morales. Parecen exhibir sin pudor un gravísimo escepticismo acerca de la responsabilidad pública de sus acciones profesionales."21

Parece imprescindible construir un sentido ético global que pueda, al mismo tiempo, ser interpretado a la luz de las diversidades culturales en las que se inserta cada persona. Ya no se trata sólo de reflexionar sobre los valores morales que sustentan el respeto por los derechos humanos individuales sino de conceptos más difusos y globales como el respeto por el ecosistema o el derecho de las generaciones venideras a un ambiente rico y diverso.

(Recibido: julio de 2003. Aceptado: agosto de 2003).

Referencias:

EL CUIDADO DE LOS MÉDICOS QUE TRATAN PACIENTES SERIAMENTE ENFERMOS

Francisco Queralt

Especialista en Oncología Clínica. Servicio de Oncología del Hospital Italiano Garibaldi; Director del Instituto de Oncología y Especialidades Médicas, Rosario.

Resumen

Los médicos que se dedican a tratar pacientes con enfermedades graves están sometidos a presiones derivadas de las exigencias de los enfermos, de los familiares y de ellos mismos que, en general, superan a las que soportan quienes ejercen otras especialidades. El reconocimiento de las causas que generan estas tensiones es un primer paso hacia su manejo.

La experiencia recopilada en varios años de trabajo con los integrantes de un Servicio de Oncología en coordinación con una psicóloga constituyen el material que se presenta para sugerir la necesidad de que nos ocupemos del cuidado de los cuidadores.

Palabras clave: Oncología; cuidados para el médico; síndrome de agotamiento; burnout.

 

THE BURNOUT SYNDROME AMONG DOCTORS WHO TREAT SERIOUSLY ILL PATIENTS

Summary

Doctors who treat patients with severe diseases are under pressures derived from demands of patients, family members and themselves, that, in general, are overwhelmingly greater than those other medical specialists receive. The recognition of what causes these tensions is a first step to control them.

The experience gained along several years of work with the staff of an Oncological Service in coordination with a psychoanalist constitutes the material presented here, in order to suggest the need of caring for medical doctors.

Key words:Burnout syndrome; care of medical doctors; Oncology

Los pacientes seriamente enfermos presentan emociones muy fuertes que se proyectan en su entorno y en los médicos tratantes, generando en éstos una reacción emocional, que si no se concientiza lleva generalmente a respuestas desafortunadas, tanto verbales como gestuales, que no ayudan a una buena comunicación.

Una mala relación con el paciente genera en el médico sentimientos que finalmente recaen en su propio perjuicio, condicionando un "sentirse mal" que en su repetición configura el síndrome de burnout (agotamiento), reconocido con ese nombre también en la lengua castellana.

El primer instrumento que el médico debe manejar es reconocer el hecho, para poder amortiguar y minimizar el efecto de ese sentimiento en su propia vida (profesional y familiar). Tratar de bloquear los sentimientos, como instintivamente se hace, separando lo técnico de las emociones que genera, no es útil; y ante la repetición de las situaciones, el sentirse bien cuidando enfermos se va transformando en un malestar que termina atentando contra la salud mental y la posibilidad de ejercer con placer una profesión que en su dureza misma, bien manejada, puede tener su satisfacción retributiva.

Por eso decimos que el primer paso para manejarnos es aceptar que la realidad existe tal cual es, y que si nos instrumentamos seremos más útiles a los pacientes y además, y a eso se refiere esta presentación, a nosotros mismos.

En el ideario popular, el médico tiene la obligación de hacerse cargo de las necesidades del paciente, sin importar lo que el médico sienta. Obviamente falso, pero aceptado por usos en los cuales no estamos libres de culpas, exacerbado todo esto por un sistema perverso que despersonaliza la labor médica (trabajo a destajo, pésimos honorarios pagados mal y tarde, juicios por malapraxis, etc.). Si no aprendemos a cuidarnos nosotros mismos, nadie nos defenderá.

Por eso mi propuesta de comenzar a cuidarnos los cuidadores. Los que estamos más allá de la mitad de la carrera tenemos presente la época en que el médico tenía respeto social, mejores honorarios, más consideración, menos explotación y muy esporádicos juicios por malapraxis. Todo esto ha cambiado y quizás sea difícil revertirlo, especialmente para los jóvenes; pero por lo menos, entiendo que se deben usar los medios disponibles, simples muchas veces, desconocidos en general, que nos permitan disminuir nuestra exposición.

En el Servicio de Oncología del Hospital Italiano Garibaldi desde hace varios años hemos construido un lugar de reflexión, durante dos horas semanales, coordinado por un psicólogo, para poder plantear entre iguales los pacientes que nos pesan, aquéllos que regresan a la mente, los que nos quitan el sueño...

En nuestro grupo no hemos descubierto nada que desde la Psicología no se maneje desde hace mucho: a la transferencia-contratransferencia, teóricamente, todos la conocemos. Lo que creemos importante es poder reconocerla en la práctica y utilizarla en beneficio de la relación en lugar de actuarla irracionalmente. El reconocimiento de este hecho y la regulación racional (no demasiado cerca, no demasiado distante) es un requisito indispensable y primario para comenzar a mejorarse.

Una lista de las cosas que nos pasan es quizás una manera de tener conciencia. Si estamos alerta, esto puede ser fácil de reconocer en nuestros sentimientos y actitudes (Tablas I y II). El estar conscientes de la existencia hace que el profesional médico pueda reconocer el hecho perturbador y hacer lo posible para ponerlo en evidencia con más claridad y poder manejarlo.

Uno de los problemas que vemos con más frecuencia es la exigencia desmedida que tienen los familiares, mucho más que los enfermos, en momentos difíciles de la situación de los pacientes y donde afloran los problemas interpersonales de la familia, las "cuentas pendientes"; esas exigencias son a veces más difíciles de manejar que la propia enfermedad, porque son la manifestación de desplazamiento de sentimientos para sacarse de encimas las culpas y ponerlas... en el médico.

Reconocidas las emociones y las conductas instintivas que las generan, busquemos las causas; en general no es una sino múltiples, lo que hace más complejo su reconocimiento.

Es útil poder reconocer las fuentes de satisfacción o insatisfacción, que si bien son investigadas especialmente en Oncología, resultan iguales en otras especialidades que quizás no tengan la connotación de gravedad que tiene la Oncología (Tablas III y IV).

Entre las fuentes de satisfacción que encuentran los médicos, más del 85% destaca la buena relación con los pacientes y sus familiares. El logro de esta buena relación puede tener un alto contenido de espontaneidad, pero sin duda, con entrenamiento se puede agregar un porcentaje importante de mejoría de tales relaciones.

Como contraparte, el sentir que se carece de instrumentos para manejar las situaciones genera altos niveles de estrés.

La sospecha de que el burnout se produce por acumulación a través del tiempo no parece ser verdadera, ya que el mayor porcentaje e intensidad del mismo aparece en los médicos jóvenes, como si el aprendizaje a través del tiempo pudiese proteger del síndrome. Los niveles de agotamiento parecen ser similares en las diferentes especialidades, lo cual significa que la gravedad objetiva de la enfermedad no es la causa principal del mismo, sino otros factores.

Si el médico no puede reconocer y examinar sus sentimientos con relación a un paciente, sin duda la relación no será fluida, se verá resentida y tendrá consecuencias.

Si fallamos al identificar las vivencias y las expectativas del paciente, y proponemos conductas incoherentes sin tener en cuenta las necesidades, estamos en el comienzo de una mala relación que también caerá sobre nosotros.

Esto genera un sentido de insuficiencia y futilidad de nuestros conocimientos y conductas con una pérdida del valor y objeto de nuestro trabajo. Mejorando el alerta sobre los propios sentimientos se mejora la salud del médico.

Si bien los datos son dispersos y limitados, hay un cúmulo de informaciones que orientan en este sentido. Son temas que no se tratan, por lo menos de una manera útil en la formación del médico, ni siquiera en el postgrado.

Por todo esto, y porque entiendo que tenemos la obligación de informarlo a las generaciones más jóvenes, es que estoy proponiendo que tengamos una mirada atenta a este tema que trata, nada más y nada menos, que de nuestra salud.

(Recibido: mayo de 2003. Aceptado: mayo de 2003).

 

Tabla I. SÍNTOMAS DE ATENCIÓN QUE INFLUENCIAN EL CUIDADO DE LOS PACIENTES (Emociones)

• Enfado con el paciente o la familia.
• Sentimiento de acoso por el paciente o la familia.
• Sentimiento de desprecio por el paciente o la familia.
• Sensación de culpa.
• Sensación de obligación personal de salvar al paciente.
• Sensación de ser víctima de las demandas de la práctica médica.

Tabla II. SIGNOS DE ATENCIÓN QUE INFLUENCIAN EL CUIDADO DE LOS PACIENTES (Conductas)

• Evitar al paciente y/o a la familia.
• Prestar poca atención a los detalles del paciente.
• Dificultad para comunicarse con los colegas que comparten un paciente.
• Tensión cuando se ve al paciente o a la familia.
• Contactos excesivamente frecuentes para lo médicamente necesario.

Tabla III. FACTORES DESCRIPTOS COMO LAS FUENTES PRINCIPALES DE SATISFACCIÓN EN RELACIÓN AL TRABAJO.

• Buena relación con el paciente 97%
• Buena relación con la familia 79%
• Reconocimiento profesional 72%
• Estímulo intelectual:
• de la enseñanza 53%
• de la investigación 38%
• del aprendizaje 38%
• Recursos adecuados:
• tener un buen grupo de trabajo 54%
• tener buenos recursos financieros 34%

Tabla IV. FACTORES DESCRIPTOS COMO FUENTES DE STRESS

 

Bibliografía

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HEMORREOLOGÍA: COMPORTAMIENTO INTRÍNSECO DEL FLUJO SANGUÍNEO

Marta L. Rasia*, Graciela B. Bazzoni

Cátedra de Física Biológica. Facultad de Ciencias Médicas, UNR.

Resumen

La sangre es una suspensión concentrada de células muy especializadas en una solución electrolito-proteica. Su complejo comportamiento fluido demuestra su extraordinaria adaptación como tejido circulante. El movimiento perfectamente coherente de las células sanguíneas en la macro y microvasculatura es complicado, variable en sus detalles mecánicos y aún incompletamente comprendido.

La aplicación de los conocimientos de la física de los fluidos a la sangre constituye la Hemorreología. Dicho estudio permitió comprender su "viscosidad anómala": la viscosidad de la sangre es muy alta cuando la velocidad de flujo es baja pero remarcablemente baja cuando la velocidad es alta; este fenómeno depende de dos características de los eritrocitos: la tendencia, en estasis, de agregarse formando "pilas de monedas" y la capacidad de deformarse y orientarse favoreciendo el flujo cuando la velocidad es alta. También demostró cómo la evolución logró optimizar el transporte de oxígeno quitando el núcleo a los eritrocitos: simplificando su estructura otorgó a los mamíferos elementos corpusculares más aptos que además permitieron redes capilares más espesas. La aplicación de la reología hemática en la Medicina Clínica deviene de la repetida observación, en ciertos síndromes de hiperviscosidad, de una resistencia más elevada que en los casos más conspicuos de hipertensión vasorreactiva. Además, en la casi totalidad de las patologías circulatorias existe algún trastorno de base hemorreológica que es directamente proporcional a la gravedad del proceso. Estas observaciones, sumadas a las aplicaciones terapéuticas, han hecho de la reología sanguínea un nuevo polo de atención para las Ciencias Médicas.

Palabras claves: hemorreología; reología sanguínea; viscosidad sanguínea; deformabilidad eritrocitaria; agregabilidad eritrocitaria.

HEMORHEOLOY: INTRINSIC BEHAVIOUR OF BLOOD FLOW.

Summary

Blood is a concentrated suspension of highly specialized cells in an electrolyte-protein solution. Flow behaviour of blood is remarkably complex, besides demonstrating its outstanding adaptation as a circulating tissue. The perfectly coherent movement of blood cells in the macro- and microvasculature constitutes a complex process, highly variable in its mechanical details and incompletely understood so far. Hemorheology applies physical knowledge of fluids to blood. Its study allows us to understand the classically called "anomalous viscosity" of blood: a peculiarity involving very high viscosity when the flow velocity is low, and remarkably low viscosity when the flow velocity is high. Elicited by the shear velocity, normal human erythrocytes undergo two different processes: on one hand, the tendency to aggregate building "rouleaux" in stasis; and on the other hand, the ability to deform and orientate improving flow at high velocity.

Moreover, the behaviour of the erythrocytes in flow leads to realise that evolution attained optimization of oxigen transport by removing the cell nucleus. By simplifying erythrocyte structure, mammals were given better corpuscular elements that, in turn, allowed denser capilary networks. The application of hemorheology in Clinical Medicine came out of a repeated observation: some hiperviscosity syndromes can rise flow resistance more than the more conspicuous cases of vasoreactive hypertension. Furthermore, in many circulatory pathologies underlie some hemorheological disorders whose magnitude is directly proportional to the severity of the process. These observations, and their potential therapeutic applications, turn blood rheology into a new focus of attention for Medical Sciences.

Key words: hemorheology; blood rheology; blood viscosity; erythrocyte deformability; erythrocyte aggregability.

Reología (esa rara palabra cuyo significado jamás podríamos adivinar por su similitud a otras de uso corriente) es el nombre de la ciencia que estudia la deformación y el flujo de los materiales. Hace unos 40 años algunos biólogos se tentaron de aplicarla a los materiales biológicos –y como es ya conocido en otros aspectos– estos materiales mostraron un comportamiento endemoniadamente complejo. La complejidad de los sistemas biológicos y de sus estructuras plantearon nuevos problemas a la Reología básica. Pero ésta también ha mostrado que un gran número de procesos biológicos están controlados o conectados por las propiedades reológicas de su entorno (órganos, fluidos o células).

La aplicación fisiológica más relevante corresponde a la sangre. Por su carácter de órgano circulante las propiedades reológicas de la sangre son fundamentales para el cumplimiento de su función de transporte. Esto explica porqué el mayor peso de las investigaciones biorreológicas en los últimos veinte años ha recaído sobre la sangre. El complejo comportamiento reológico de la sangre es motivo de investigación para físicos, hematólogos, fisiólogos, angiólogos y otros especialistas.

En los últimos años, los avances logrados en este terreno han contribuido a cambiar una serie de conceptos hemodinámicos y fisiopatológicos que parecían firmemente establecidos y, además, dieron lugar a un creciente y extraordinario progreso de la terapéutica en patología vascular.

Se sabe que la resistencia al flujo sanguíneo –un problema importante que se asocia a muchas patologías– depende de la geometría del circuito vascular y de las propiedades de flujo de la sangre. En la clásica ecuación propuesta por Poiseuille, el predominio del radio está dado por la cuarta potencia a la que aparece elevado, lo que determina que cualquier variación del radio vascular tenga una exagerada incidencia en la resistencia al flujo. Por esa razón, el radio vascular es el principal instrumento en la regulación fisiológica del flujo sanguíneo.

Estos antecedentes determinaron que la vasoconstricción fuera, por mucho tiempo, el eje de los estudios fisiopatológicos y farmacológicos de la resistencia al flujo. Pero recientemente, la observación reiterada de que el aumento de la viscosidad sanguínea puede elevar la resistencia al flujo varias veces más que la vasoconstricción más conspicua, atrajo la atención de los científicos sobre este parámetro y dio relevancia a la hemorreología o reología sanguínea.

Estudiar la reología sanguínea implica entendérselas con un medio heterogéneo cuya composición y estructura cambian con el tiempo y cuyos componentes tienen características físicas que dependen de su estado y movimiento. La complejidad de sus características viscosas se debe a que es una suspensión de células en una solución electrolito-proteica y además, a las particularidades tan especiales de las células que la componen:

• los glóbulos rojos, partículas de gran tamaño para los vasos capilares, constituyen casi el 50 % del volumen de la sangre, y sus propiedades de deformabilidad y capacidad de agregación los hacen netamente diferentes de las partículas que forman parte de suspensiones no biológicas.
• los glóbulos blancos, que si bien constituyen solo el 0,7% del volumen sanguíneo, son voluminosos para los vasos de la microcirculación y adhesibles a sus paredes cuando se activan.
• las plaquetas, que en la inmediata vecindad de la pared vascular pueden reaccionar y adherirse y eventualmente generar un trombo mural.

Desde principios del siglo pasado se reconoce que la viscosidad de la sangre tiene características diferenciales con respecto a cualquier otro líquido conocido. Dentro de ciertos límitesla viscosidad de la sangre disminuye cuando aumenta la velocidad con que se mueve y también disminuye cuando disminuye elcalibre del vaso por el que circula. Por esto la viscosidad de la sangre no es una constante, sino que depende de las condiciones de flujo.

COMPORTAMIENTO REOLÓGICO DE LA SANGRE:

Como en toda suspensión de partículas sólidas en líquido, la viscosidad sanguínea depende principalmente de la concentración de partículas, es decir, del hematocrito. Pero en comparación con las otras suspensiones de igual concentración, la viscosidad sanguínea es extremadamente baja. Esto se debe a las propiedades mecánicas muy particulares de los eritrocitos que sólo alteran mínimamente el flujo plasmático adaptándose pasivamente a la corriente.

En efecto, al hematocrito fisiológico normal (40-50%), la gran aglomeración de partículas debería dificultar el flujo. Esto puede ser visualizado en el siguiente ejemplo: imaginemos una sala de 20 m2 en las que se encuentran 120 niños. A cada uno le corresponde una superficie de 50 x 33 cm de la cual cubre la mitad, de modo que dispone de un espacio libre similar a su propia superficie. La falta de espacio es marcada en estado de reposo y se hace alarmante cuando los niños comienzan a moverse, v. g. si quieren abandonar la sala a través de una puerta que sólo deja pasar 4 ó 5 simultáneamente. Si no lo hacen en forma muy disciplinada, el movimiento implica trabas recíprocas.

En la sangre, la naturaleza consiguió disminuir al mínimo ese rozamiento entre células quitando el núcleo del eritrocito y transformándolo en una bolsita semivacía. Esto le confiere la habilidad de escurrirse entre los otros glóbulos rojos adaptándose a las líneas de flujo, en lugar de alterarlas como ocurre con las partículas sólidas.

A alta velocidad de flujo la sangre es más fluida que cualquier suspensión de partículas sólidas e incluso que las suspensiones de gotas líquidas (aceite en agua) de igual concentración. Esto demuestra que la fluidez de la sangre depende directamente de la gran deformabilidad de los eritrocitos, favorecida por la holgada membrana que la rodea.

La otra característica diferencial de los eritrocitos se manifiesta cuando el flujo se enlentece: los eritrocitos forman agregados disminuyendo la fluidez sanguínea. Este comportamiento que se denomina tixotropía es frecuentemente utilizado en la industria. Por ejemplo: en las pinturas, la tixotropía hace que fluyan con facilidad bajo la tensión cizallante que ejerce el movimiento del pincel, pero en reposo el aumento notable de la viscosidad provocado por la asociación de las partículas impide que chorreen.

REOLOGÍA DE LOS GLÓBULOS ROJOS:

La forma bicóncava del eritrocito en reposo ha inspirado frecuentemente la fantasía de los investigadores dando origen a un gran número de teorías respecto de sus causas y de los efectos de esta configuración tan especial.

La optimización del transporte de O2 comenzó con la aparición de proteínas específicas –como la hemoglobina– presentes en forma libre en la linfa hemática. Con la aparición de las células rojas se logró aumentar la capacidad de transporte, pero el flujo se vio amenazado de obstrucción especialmente en los territorios terminales.

Los glóbulos rojos primitivos (aves y anfibios) son nucleados, y por lo tanto más grandes y menos deformables, exigiendo que los capilares sean más anchos y necesariamente más espaciados. A igual longitud, un capilar de rana (f : 15 m m) es 16 veces mayor que un capilar de mamífero (f : 3,8 m m); en consecuencia, el mismo volumen de sangre que ocupa un capilar en los animales más primitivos, se reparte en 16 capilares en el mamífero. El reemplazo de un capilar grueso por 16 capilares finos redunda en un aumento de la superficie de intercambio y una disminución de la distancia entre la sangre y las células tisulares.

La evolución ha dotado a los mamíferos de eritrocitos que pierden el núcleo durante su maduración quedando semi-vacíos. Estas células tienen menor tamaño, una mayor concentración corpuscular de hemoglobina y una membrana holgada que –sumada a la carencia de estructuras elásticas en el interior– aumenta notoriamente su deformabilidad. Espontáneamente toman la forma bicóncava en ausencia de fuerzas externas, pero varían constantemente su conformación cuando fluyen y son capaces de plegarse para atravesar con facilidad vasos menores que la mitad de su diámetro. La gran fluidez de los eritrocitos anucleados es fundamental para la libre circulación sanguínea través de los capilares y otorga innumerables ventajas a los sistemas cardiocirculatorio y respiratorio.

El glóbulo rojo y la microcirculación son ejemplos de cómo una función puede ser resuelta óptimamente cuando la estructura se simplifica. En conjunto, los mamíferos gozan de elementos corpusculares más aptos y redes capilares más espesas, con lo cual se mejora en grado óptimo el transporte de O2, aunque necesariamente aumenta el riesgo de obstrucción.

Adaptación de los eritrocitos al flujo:

El eritrocito posee una elevada capacidad de adaptación a las condiciones de flujo en los diferentes sectores vasculares.

Desde el punto de vista reológico, el flujo sanguíneo en el circuito circulatorio puede ser dividido diagramáticamente en tres grandes áreas de acuerdo a la relación entre el diámetro del vaso sanguíneo y el del eritrocito (Figura 1).

a. Circulación sistémica: arterias y venas (f vaso > 50 f eritrocito): En esta zona la velocidad de flujo es alta y el comportamiento viscoso de la sangre no presenta una sustancial diferencia con la del plasma libre de células. En este sector, se puede visualizar el flujo como láminas líquidas en disposición telescópica que se deslizan unas sobre otras, ejerciendo una fuerza sobre las células suspendidas y que son progresivamente alargadas y obligadas a rotar sobre sí mismas. Esto provoca una circulación de la membrana alrededor del contenido en forma de oruga de tanque que da origen a un flujo rotatorio del citoplasma (Figura 2).

Otra importante consecuencia de las fuerzas que producen deformación y rotación es la migración de las partículas desde la pared hacia el eje del tubo, Este fenómeno origina una zona de exclusión (plasma libre) en contacto con la pared de aproximadamente 4 m m y un hematocrito máximo en el centro del tubo.

b. Microcirculación: arteriolas y vénulas (f vaso entre 1 y 50 veces el f eritrocito). En este área la adaptación de las partículas al flujo es similar a la descripta para la circulación sistémica, pero los diámetros vasculares son suficientemente pequeños para que el espesor de la capa de plasma marginal y la acumulación axial de las células provoquen los máximos efectos determinando las propiedades anómalas de la sangre.

En la microcirculación, la capa de plasma marginal tiene un espesor relevante en relación al radio de los vasos y funciona como una capa lubrificadora en la proximidad de las paredes que favorece el deslizamiento y provoca una disminución de la viscosidad sanguínea, fenómeno que se hace más marcado a medida que disminuye el radio vascular.

Pero hay otro efecto típico de esta área que también disminuye la viscosidad cuando decrece el radio vascular: se debe a que el plasma, enlentecido en la proximidad de la pared, permanece más tiempo en los vasos que los eritrocitos, acelerados en el flujo axial. Esto da lugar a un fenómeno muy llamativo: en la microcirculación el hematocrito es más bajo que en los grandes vasos (arterias y venas) y disminuye conforme se angostan los vasos. El fenómeno, que se manifiesta para tubos de diámetro menor que 150 m m se conoce con efecto Fahreus-Linqvist y su causa intrigó por décadas a los científicos.

c.- Circulación capilar (f vaso < f eritrocito). El diámetro promedio del eritrocito es 7,3 m m y el de los capilares angostos puede ser inferior a 3 m m. Por lo tanto, para atravesarlo las células deben deformarse extremadamente, lo logran tomando la forma de babucha o paraguas semicerrado.

Durante el transcurso del capilar, en el eritrocito plegado, la membrana sigue movilizándose alrededor del contenido celular y dando lugar a un efecto de amasado del mismo, de modo que la hemoglobina oxigenada y la desoxigenada son permanentemente mezcladas favoreciendo el intercambio de O2 con el medio (Figura 2).

En resumen, si observamos la biconcavidad del eritrocito con criterio reológico tenemos que recordar que el exceso de superficie le permitedeformarse sin que su membrana sea distendida y responder a fuerzas asimétricas con un movimiento de rotación. En flujo, el eritrocito va tomando formas contínuamente cambiantes mientras rota sobre sí mismo, por lo que se desliza con una mínima pérdida de energía por rozamiento (un objeto que rueda sufre mucho menos frenado que si se arrastra). Esto favorece su circulación tanto en los vasos grandes donde se escurre entre sus pares, como en los capilares donde sufre la máxima deformación por ser el diámetro del vaso considerablemente menor que el de su forma en reposo.

FORMACIÓN DE ROULEAUX Y FLUIDEZ SANGUÍNEA

Los glóbulos rojos humanos tienen tendencia a reunirse por sus caras formando pilas de monedas o rouleaux (Figura 3). Estas pilas al crecer pueden ramificarse y constituir redes de pilas de monedas. Clásicamente este fenómeno se atribuye a las macromoléculas de mayor tamaño (fibrinógeno y globulinas) que producen las uniones entre eritrocitos adyacentes.

Las uniones formadas son muy débiles y se rompen cuando los agregados son cizallados por el flujo. Por lo tanto, el proceso de agregación es reversible: cuando la velocidad de flujo es baja o nula se forman agregados que se rompen cuando la velocidad de flujo aumenta (Figura 4).

La agregación eritrocitaria ocupa un destacado papel en la reología sanguínea porque le confiere a la sangre tixotropía. Cuando el flujo sanguíneo se enlentece, la formación de agregados produce un aumento de la viscosidad y a la inversa, cuando la corriente sanguínea aumenta, la ruptura de los agregados por el cizallamiento produce una notoria disminución de la viscosidad.

Por lo visto hasta acá, la viscosidad de la sangre es función de la concentración celular y de las propiedades celulares: la deformabilidad y la agregabilidad. Como estas últimas variables son dependientes de la velocidad de flujo, la viscosidad también lo es. Las mediciones realizadas in vitro demuestran que en condiciones de alto flujo, la viscosidad de la sangre es baja debido a la dispersión de los eritrocitos y su deformabilidad individual. Pero en condiciones de bajo flujo, cuando el cizallamiento es insuficiente la viscosidad sanguínea aumenta agudamente por la formación de rouleaux debido a la presencia del fibrinógeno y las globulinas.

En condiciones fisiológicas, la velocidad de flujo es suficientemente elevada como para prever que los eritrocitos circulan desagregados, aunque este pronóstico es dificultoso dada la gran complejidad de la geometría del circuito circulatorio. En las vénulas y pequeñas venas el esfuerzo de corte o cizallamiento es menor y por lo tanto la probabilidad de formación de rouleaux es mayor.

La velocidad de eritrosedimentación es un índice de la agregabilidad eritrocitaria: los eritrocitos agregados ofrecen menor resistencia a la caída por efecto gravitatorio. Por lo tanto, las condiciones que promueven la agregación son las que determinan el aumento de la velocidad de eritrosedimentación.

En condiciones patológicas, por aumento de las proteínas plasmáticas o por disminución de la velocidad de circulación puede resultar favorecida la formación de rouleaux y también su resistencia a desagregarse. La agregación patológica puede provocar obstrucciones por dos mecanismos: a) por formación de redes densas de agregados o grumos de glóbulos rojos resistentes a las fuerzas cizallantes locales, pero más comúnmente b) porque la aglomeración de los glóbulos rojos en el eje del tubo produce la exclusión de los glóbulos blancos y plaquetas que son desplazados de la zona central hacia las paredes del vaso aumentando la probabilidad de su interacción con el endotelio vascular. En los pequeños vasos la marginación es acompañada de adhesión y extravasación de los granulocitos. Esta situación es típica de los procesos inflamatorios y situaciones de bajo flujo (reacción de fase aguda).

REOLOGÍA DE LOS GLÓBULOS BLANCOS

Los leucocitos sólo constituyen el 0,1% de todas las células sanguíneas pero su influencia sobre la circulación capilar es desproporcionada a ese número por dos razones: a) ellos son grandes y esféricos; b) su contenido es mucho más rígido que el de los glóbulos rojos y por lo tanto son menos deformables. Por ambas razones necesitan alta presión para circular por vasos angostos y su tránsito por los capilares frecuentemente se asocia a enlentecimiento y cese momentáneo del flujo (Figura 5).

Este taponamiento transitorio ocurre frecuentemente bajo condiciones normales de presión y flujo y no interfiere en el adecuado intercambio de nutrientes. Pero en circunstancias en que la presión de perfusión es reducida pueden aparecer verdaderos disturbios del flujo microvascular: la oclusión capilar puede resultar prolongada e incluso permanente; más aún las arteriolas y las vénulas pueden presentar una considerable disminución de su luz por adhesión de los glóbulos blancos al endotelio.

Existen al menos tres mecanismos por los que los leucocitos pueden contribuir a la injuria microvascular. Uno de ellos es el taponamiento mecánico de los capilares. Los otros dos provienen del efecto de una variedad de estímulos que provocan: a) aumento de su adhesividad (fijación a las paredes vasculares con disminución de la luz y formación de agregados que se constituyen en émbolos) y b) liberación de sustancias tóxicas normalmente destinadas a los invasores microbianos, pero que, en el interior vascular producen injuria endotelial.

Por estas razones pueden producir un deterioro general de la microcirculación o ser los mediadores del infarto de órganos vitales y se los considera factores de riesgo en cualquier enfermedad oclusiva periférica como el infarto de miocardio, la isquemia cerebral y la aterosclerosis. Después de haberse observado que ningún tratamiento farmacológico ofrece un grado tan elevado de protección contra el daño isquémico como la remoción de los granulocitos, se los ha catalogado como perpetradores insidiosos del daño tisular isquémico y post-isquémico.

REOLOGÍA DE LAS PLAQUETAS

Los trombocitos son, después de los eritrocitos, las células sanguíneas más numerosas. Pero debido a su pequeño tamaño (longitud media 3 m m), tienen poca influencia sobre la fluidez de la sangre normal. Son células muy especializadas en tres funciones: adhesión a estructuras de la pared vascular lesionada; agregación, es decir, su adherencia a otras plaquetas para formar grandes tapones hemostáticos; y, secreción de mediadores que actúan sobre otras plaquetas, sobre el endotelio y el sistema de coagulación (Figura 6 A).

Cuando se hallan inactivas, las plaquetas normales se orientan en el flujo y pueden rotar alrededor de su eje, pocas veces se rozan entre ellas y si lo hacen no se produce una interacción duradera. El gran número de eritrocitos impide a su vez que ellas se toquen frecuentemente.

Cuando se activa el aparato contráctil y secretor de las plaquetas debido a algunos de los múltiples estímulos que inciden sobre la membrana, las plaquetas sufren metamorfosis viscosa con la formación de pseudopodios. Una vez activadas, pueden adherirse a diferentes superficies: a otras plaquetas, células tumorales, bacterias y otros cuerpos extraños. Pero sin la existencia de la corriente sanguínea las plaquetas no pueden formar agregados (Figura 6 B).

Después de la activación de los trombocitos, ellos mismos estimulan y apoyan el proceso de coagulación.

Existen numerosos indicios de que la arteriosclerosis es un proceso de depósito en determinados sectores del sistema vascular y que depende de la función plaquetaria. Por las presiones de flujo presentes, las plaquetas se adhieren en los grandes vasos, especialmente en las bifurcaciones donde existe un mayor desplazamiento de sangre (y con ello de plaquetas) en dirección a las paredes vasculares (ramificaciones, curvas, estrechamientos, etc.).

Últimamente se ha demostrado que la activación plaquetaria se encuentra aumentada en numerosas enfermedades vasculares. En tales circunstancias, la adhesión y agregación plaquetaria se desarrollan principalmente a nivel de las arterias y los trombos pueden llegar a ocluir total o parcialmente los vasos. Las investigaciones realizadas han demostrado que en las ramificaciones o a posteriori de una estenosis las características del flujo laminar se alteran. Al cambiar bruscamente la velocidad y dirección del flujo y originarse una recirculación contra las paredes vasculares, se favorece la activación plaquetaria. En las estenosis, donde existen elevadas fuerzas de cizallamiento, los eritrocitos son altamente deformados pueden llegar a romperse y liberar su contenido. El ADP liberado por los eritrocitos rotos es un factor que estimula la activación de las plaquetas.

CONCLUSIÓN

La sangre cumple la función capital de suministrar a los tejidos nutrientes y O2 conforme a sus necesidades. Dada la variabilidad de los requerimientos tisulares, la naturaleza creó un mecanismo de control del flujo que se fundamenta en la ecuación de Poiseuille:

donde: R: resistencia al flujo; l: longitud del vaso; r: radio del vaso; h : viscosidad sanguínea; 8 y p son constantes.

Siendo invariante la longitud de los vasos, la resistencia al flujo queda determinada por la viscosidad sanguínea en forma directa y por la 4ª potencia del radio vascular. Por lo tanto demuestra la dramática incidencia del radio y explica como son posibles importantes variaciones de flujo con pequeñas modificaciones de la luz arteriolar controlada miogénicamente.

Por esta causa toda la atención de la Fisiopatología y de la Farmacología en relación al flujo y a la resistencia se centró en el radio arteriolar. Pero actualmente se sabe que el otro factor, la viscosidad sanguínea, puede, en algunos síndromes de hiperviscosidad, elevar la resistencia por encima de los valores observados en los casos más conspicuos de hipertensión vasorreactiva.

Se ha demostrado que en la casi totalidad de las patologías circulatorias existe algún trastorno de base hemorreológica. En procesos arteriales y metabólicos tales como enfermedades vasculares –cerebral o periférica–, diabetes, infarto agudo de miocardio, retinopatías, dislipidemias y procesos de fase aguda hay un aumento de viscosidad sanguínea con pérdida de la deformabilidad eritrocitaria, y se ha observado que esta alteración reológica es directamente proporcional a la gravedad del proceso. Cuando se instaura un déficit de irrigación tisular que las arterias no pueden compensar fisiológicamente por vasodilatación debido a su propio deterioro, aparecen las alteraciones reológicas concomitantes que a su vez deterioran aún más la irrigación, dando lugar a un círculo vicioso que debe ser considerado en la intervención terapéutica.

Por otro lado se demostró que la terapia vasodilatadora en los síndromes isquémicos puede provocar una sobreperfusión de las zonas normales aumentando el detrimento de las mal perfundidas.

Estas observaciones hicieron de la reología sanguínea un nuevo polo de atención para las Ciencias Médicas.

(Recibido: abril 2003. Aceptado: julio 2003)

Bibliografía

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3. Rampling MW: Haemorheology and the inflammatory process (Review). Clin Hemorheol Microcirc 19:129-32, 1998.

ESTUDIO IN VITRO DE LA INFECCIÓN AGUDA CON TRYPANOSOMA CRUZI EN DOS CEPAS MURINAS DE DISTINTA SUSCEPTIBILIDAD. INMUNOMODULACIÓN CON LPS, PENTOXIFILINA E INTERFERÓN GAMMA*

Ana Rosa Pérez, (1)** Maximiliano Tamae-Kakazu, (1) Eduardo Roggero, (1) Esteban Serra, (2) Silvia Revelli, (1) Jeanne Wietzerbin, (3) Oscar Bottasso. (1)

1) Instituto de Inmunología, Facultad de Cs. Médicas, UNR, Argentina.

2) Instituto de Biología de Rosario IBR-CONICET, Facultad de Cs Bioq. y Farmacéuticas, UNR, Argentina..

3) Unité 365 INSERM, Instituto Curie, París, Francia.

Resumen

La infección con T. cruzi en ratones BALB/c y C57BL/6 provoca en ambas cepas una enfermedad aguda, caracterizada por parasitemias bien evidentes, espleno y adenomegalia, infiltrados inflamatorios y atrofia tímica. Los ratones C57BL/6 presentan una mortalidad del 100%, mientras que un 60% de los BALB/c superan la fase aguda. Basándonos en estos hechos, se estudió si las disimilitudes en cuanto al desenlace de la enfermedad estaban relacionadas con diferencias en el comportamiento de los Mf ante la infección in vitro con T. cruzi. No se observaron diferencias entre cepas respecto al número de parásitos intracelulares y derivados del NO en los SN, no así en los niveles de FNTa que fueron significativamente superiores en los SN de los Mf C57BL/6. Para reducir esta respuesta, los ratones C57BL/6 fueron desensibilizados in vivo con LPS y Ptx y sus Mf expuestos in vitro al T. cruzi, observándose una menor producción de citoquinas inflamatorias y un aumento en el número de amastigotes. El agregado de IFNg in vitro reactivó las funciones parasiticidas de los Mf . La gravedad de la infección con T. cruzi en los ratones C57BL/6 no parece relacionarse con una mayor carga parasitaria, sino más bien con una producción excesiva de citoquinas inflamatorias.

Palabras clave: tripanosomiasis experimental; Chagas; ratón; inmunomodulación; citoquinas.

IN VITRO STUDY OF ACUTE TRYPANOSOMA CRUZI INFECTION IN 2 MURINE STRAINS OF DIFFERENT SUSCEPTIBILITY. IMMUNOMODULATION WITH LPS, PENTOXYPHILLINE, AND GAMMA-INTERFERON.

Summary

Infection with T. cruzi in BALB/c and C57BL/6 mice leads to an acute disease characterised by marked parasitemia, spleen and lymph node enlargement, inflammatory infiltrates and thymic atrophy. The disease is 100% lethal in C57BL/6 mice, whereas 60% of BALB/c mice recovered. With this background, we have now studied whether such disease-outcome differences bear some relationship with the in vitro behaviour of peritoneal macrophages (Mf ) to their encounter with T. cruzi. There were no between-strain differences as to the number of intracellular parasites and NO derivatives in culture supernatants, this not being the case for TNFa whose levels were significantly higher in cultures from C57BL/6 mice. To ameliorate the latter response, C57BL/6 mice were next subjected to an in vivo desensitization with LPS and PTx, and their Mf were further exposed in vitro to T. cruzi. This resulted in a decreased production of inflammatory cytokines, but an increased number of amastigote counts, that were lowered when adding IFNg to in vitro cultures. Increased severity of acute T. cruzi in C57BL/6 mice does not seem to be related with a greater parasite load, but to an excessive synthesis of inflammatory cytokines.

Key words: experimental tripanosomiasis; Chagas’ disease; mouse; immunomodulation; cytokines.

Introducción

Enfermedad de Chagas

La enfermedad de Chagas es una parasitosis causada por el protozoo Trypanosoma cruzi, la cual afecta aproximadamente a 20 millones de personas en América Latina y a 2,3 millones en Argentina.1 El grupo poblacional más afectado es aquél que habita zonas rurales y que posee bajos recursos.

La infección con T. cruzi puede transmitirse a través de las deyecciones del vector, por transfusiones sanguíneas, por vía congénita o transplantes de órganos.2

Esta parasitosis se desarrolla en tres etapas: aguda, indeterminada y crónica. La fase aguda comprende un período de incubación de cuatro a ocho semanas, que puede pasar inadvertida o bien presentar fiebre y linfoadenopatías generalizadas.3 En esta etapa inicial de la infección se detectan parásitos intracelulares en los tejidos afectados, principalmente en forma de quistes llamados "nidos de amastigotes", como así también tripanosomas en sangre.

Una vez transcurrido el período agudo, en donde se ha desarrollado una respuesta inmune específica, la sintomatología desaparece y se produce una depuración de parásitos en circulación. Este período recibe el nombre de fase indeterminada, la cual puede durar indefinidamente. El único signo que evidencia la infección en estos pacientes es la positividad de las pruebas serológicas.4 Durante la fase crónica pueden presentarse tanto lesiones cardíacas (miocardiopatía chagásica) como gastrointestinales (megavísceras). Aproximadamente un 30% de la población infectada presenta estas manifestaciones clínicas.

Trypanosoma cruzi: Agente etiológico de la enfermedad de Chagas

La infección en el ser humano ocurre por penetración del T. cruzi –como tripomastigote metacíclico infectivo– en el torrente sanguíneo vehiculizado por las heces del vector.

Los tripomastigotes metacíclicos son capaces de infectar una amplia variedad de células, entre ellas, principalmente macrófagos (Mf ). Una vez que se encuentran en el medio intracelular se transforman en amastigotes, que residen en el citoplasma. Luego los amastigotes se dividen por fisión binaria (7-9 generaciones), lisan la célula huésped y se diferencian a tripomastigotes, reingresan a los tejidos adyacentes o migran al torrente linfático o sanguíneo. El ciclo intracelular dura entre 3 y 5 días (Figura 1).5

Interacción huésped - parásito y respuesta inmune en la infección con Trypanosoma cruzi

Fase aguda

En el huésped infectado con T. cruzi, la respuesta inmune protectora en la fase aguda involucra principalmente la activación de Mf por el Interferón Gamma (IFNg ) y la producción de anticuerpos específicos. No se observa una respuesta T helper (Th) polarizada, sino más bien una conjunción de ambas. En este período es de gran importancia la respuesta inmune innata la cual se basa en la activación del complemento por la vía alternativa y en la activación de polimorfonucleares, Mf y células natural killer.

Durante la primoinfección, las células dendríticas y Mf que han tomado contacto con el parásito comienzan a producir interleuquina 12 (IL-12), la cual a su vez induce la secreción de IFNg por las células natural killer. La síntesis de IFNg en los primeros días post-infección está dada principalmente por estas células; sin embargo más tarde, durante la respuesta adaptativa, participarían en su elaboración las células Th1.6 Los Mf son activados por el IFNg , aumentando de esta forma su capacidad tripanomicida a través de la secreción del Factor de Necrosis Tumoral Alfa (FNTa ). En líneas generales, el IFNg solo o el IFNg más el FNTa en forma sinérgica, activan la transcripción en Mf de la Óxido Nítrico Sintasa Inducible (NOSi) responsable de la síntesis de óxido nítrico (NO) el cual posee una fuerte actividad antiparasitaria.7, 8

En cuanto al T. cruzi , experimentos in vitro han demostrado que la eliminación del parásito por Mf activados por IFNg involucra al NO.9 Además, la susceptibilidad de ratones NOSi-/- a la infección con el parásito, muestra el rol central del NO en el control de la infección in vivo.10

Durante la primera semana post-infección la respuesta inmune específica todavía no es importante pero a medida que el parásito se multiplica comienzan a aparecer los anticuerpos, los cuales podrían ser los responsables de la disminución de los niveles de parasitemia al final de la fase aguda.11 En este período, la inmunidad innata restringe a la infección mientras se desarrolla larespuesta inmune específica, a través de los linfocitos T (respuesta celular) y los linfocitos B (respuesta humoral).

Tanto en humanos como en modelos experimentales se ha documentado que en las primeras semanas post-infección se produce una activación policlonal de células T y B. Esta activación es seguida por una etapa de inmunosupresión –caracterizada por la disminución de interleuquina 2 (IL-2) y su receptor (IL-2R)– que favorecería al parásito tanto en los procesos de invasión como en los de persistencia.12

El rol de los linfocitos T CD4+ es de vital importancia en el control de patógenos intracelulares. En ratones, los clones de células T CD4+ naive o Th0 pueden diferenciarse hacia dos tipos de células, con fenotipos de secreción de citoquinas bien definidos. Las células Th1 secretan IFNg e IL-2, siendo importantes en las infecciones por parásitos intracelulares y virus. Las células Th2 secretan interleuquinas 4, 5, 6 y 10 (IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10), cooperando con los linfocitos B en la producción de los anticuerpos.

Si bien la respuesta Th1 protege al huésped de la infección, también está relacionada con el daño tisular observado en la etapa aguda en modelos experimentales de esta tripanosomiasis, debido al incremento de mediadores inflamatorios.13

Se ha observado una moderada respuesta Th2 en ratones infectados con T. cruzi, con producción de anticuerpos IgG2a compatibles con una activación policlonal tipo Th2 14 y producción de IL-10.15

El control de la respuesta protectora Th1 está a cargo de la IL-10, secretada por los Mf activados y las células Th2. La acción moduladora de esta interleuquina evitaría el daño excesivo sobre células y tejidos, ya que aunque disminuye la protección conferida por el IFNg , previene la activación de células T CD4+ asociadas a la sobreproducción de mediadores inflamatorios.

Infección in vitro con Trypanosoma cruzi en macrófagos peritoneales de cepas murinas con diferente grado de susceptibilidad ante el desafío homólogo. Tratamiento de desensibilización.

Los mecanismos efectores que permiten al huésped contener la infección aguda no se comprenden aún completamente y las diferencias en la susceptibilidad a la infección podrían ser el reflejo de variaciones cuali y cuantitativas en la respuesta inmune a T. cruzi. Con el fin de investigar este problema, se han desarrollado modelos de enfermedad chagásica experimental en diversas especies de animales de laboratorio que reproducen algunos aspectos de la patología humana. La infección con T. cruzi en diferentes cepas murinas ha sido la más empleada tanto en el estudio de la fase aguda como crónica.

En los últimos años se ha llevado a cabo en nuestro laboratorio una serie de experimentos que permitieron caracterizar dos modelos murinos con diferencias en cuanto a la severidad y resolución de la infección aguda. La inoculación de ratones C57BL/6 y BALB/c con una dosis baja de tripomastigotes de la cepa Tulahuén da lugar al desarrollo de una enfermedad aguda sistémica caracterizada por parasitemias elevadas, adeno y esplenomegalia e infiltrados inflamatorios en músculo esquelético y cardíaco. Durante la etapa aguda se comprobó pérdida de timocitos corticales, con presencia de numerosos cuerpos apoptóticos.16

En la cepa C57BL/6 este proceso se acompañaba de severa pérdida de peso, caquexia y muerte (la mortalidad fue del 100% entre los 20 y 25 días post-infección). El 60 % de los ratones BALB/c se recuperaban de la fase aguda y normalizaban su peso entre los 30 y 40 días post-infección. Las diferencias en cuanto al resultado de la enfermedad aguda guardarían relación con los niveles circulantes de mediadores inflamatorios como el FNTa , NO e IL-1b . Ambas cepas presentaron un aumento gradual en los niveles séricos de FNTa a medida que progresaba la infección. Sin embargo los niveles de esta citoquina fueron significativamente mayores en C57BL/6 a los 14 y 21 días post-infección. Por el contrario, los niveles de IL-10 fueron estadísticamente mayores en BALB/c hasta igualarse en ambas cepas el día 21 post-infección. Respecto a IL-1b , los ratones BALB/c mostraron niveles séricos de esta interleuquina 8 a 12 veces mayores que las obtenidas en C57BL/6, a los 14 y 21 días post-infección respectivamente. En lo que hace a la presencia de metabolitos del NO, si bien se detectaron a partir de la primera semana, sólo al día 21 post-infección se presentaron diferencias significativas entre ambas cepas siendo sus valores más altos en C57BL/6.17

A juzgar por las características del cuadro tóxico que se desarrolla durante la infección aguda (estado de caquexia asociado a inflamación aguda severa en múltiples órganos y muerte), sobre todo en ratones C57BL/6, es evidente que el mismo presenta algunas similitudes con los cambios que se observan en la sepsis inducida por bacterias Gram-negativas. Este evento que se genera a partir de la interacción del LPS de la pared de dichas bacterias con los Mf , da lugar a la liberación sistémica de FNTa , IL-1, IL-6 y NO [ Hirohashi, 1996] . Si se tiene en cuenta que se ha identificado un glicolípido con acciones similares al LPS en la cubierta del T. cruzi,18 es admisible pensar que parte de las consecuencias patológicas que se suceden en esta infección aguda experimental se hallan vinculadas a una desregulación en la producción de mediadores proinflamatorios –en principio esenciales para la contención de la tripanosomiasis– cuya sobreproducción puede generar daño tisular e incluso la muerte. Por lo descripto anteriormente, se justificaba la idea de establecer un protocolo experimental que pudiese disminuir la producción de FNTa en ratones C57BL/6. Esto brindaba la posibilidad de evaluar el rol del FNTa en la fase aguda, como así también de otros mediadores. Fue entonces que se desarrolló un esquema experimental de pretratamiento in vivo en forma conjunta con LPS y pentoxifilina (Ptx), en donde los ratones C57BL/6 fueron sometidos a un protocolo de desensibilización y posteriormente se los infectó con T. cruzi. Se sabe que el pretratamiento con LPS (o desensibilización al LPS) en animales de experimentación produce una reducción en los niveles de FNTa y en la mortalidad ante la inducción de shock endotóxico con la misma molécula.19 Además, desde hace unos años se conocen los efectos inhibitorios de la Ptx sobre la síntesis del FNTa , con efectos beneficiosos sobre la endotoxemia experimental.20 De este modo se comprobó que el pretratamiento con LPS más el agregado de Ptx reducía el componente perjudicial de la respuesta antiparasitaria, teniendo en cuenta que la mortalidad ante la infección en C57BL/6 disminuyó en un 50%. También disminuyó la parasitemia, el número de células apoptóticas en timo y los niveles circulantes de FNTa con respecto a los ratones no tratados.17

Desensibilización al LPS

El LPS, el principal componente de la membrana externa de bacterias Gram negativas, puede provocar una drástica respuesta biológica en el huésped, induciendo fiebre, actividad pro-coagulante, shock séptico y muerte. La desensibilización al LPS fue definida inicialmente como una reducción en la respuesta febril cuando animales de experimentación eran tratados con inyecciones de esta endotoxina y luego nuevamente desafiados con este compuesto.21 Mucho tiempo después se comprobó que este fenómeno estaba asociado a una reducción marcada en los niveles plasmáticos de FNTa y otras citoquinas proinflamatorias.22 El LPS activa a los Mf , induciendo la producción de intermediarios que incluyen NO y citoquinas tales como el FNTa , IL-1 e IL-6 tanto in vivo como in vitro. Sin embargo, durante el fenómeno de desensibilización, los Mf presentan alteraciones funcionales que pueden reproducirse in vitro ya que el pretratamiento de las células con LPS hace que éstas produzcan niveles menores de FNTa , IL-1 y IL-6 cuando son nuevamente estimuladas con esta endotoxina.23 Experimentalmente la desensibilización se logra con la administración de dosis bajas de LPS en forma reiterada (tanto in vivo como in vitro). Dicho estado de desensibilización no implica necesariamente una parálisis inmunológica sino más bien una programación diferente de la respuesta.24 Estudios recientes indican que tanto el LPS como el glicolípido de superficie del T. cruzi interaccionan con receptores del Mf funcionalmente similares, los llamados Toll-like, siendo posible inducir un estado de "tolerancia cruzada".25

Algunos estudios clínicos y experimentales señalan que el IFNg podría revertir el estado de tolerancia al LPS.26 El mecanismo por el cual esto ocurre no se conoce aún en profundidad, pero dado a que el IFNg es el principal activador de los monocitos/Mf , éste podría interferir con los mecanismos de inducción de tolerancia o bien actuar utilizando los mismos procesos que median su efecto activador sobre los Mf .

Objetivos

1. Determinar si las diferencias en la susceptibilidad ante la infección con T. cruzi en los ratones C57BL/6 y BALB/c, se asocian con un tipo de respuesta diferente por parte de los Mf peritoneales expuestos in vitro a dicho parásito.
2. Determinar si un protocolo de desensibilización in vivo con LPS y Ptx en ratones C57BL/6 es capaz de modificar las características de la infección in vitro con T. cruzi de los Mf peritoneales en cuanto a replicación parasitaria y producción de mediadores involucrados en la inmunopatogénesis de esta tripanosomiasis (nitritos, FNTa , IL-1 e IL-10).
3. Determinar si el agregado de IFNg en los Mf peritoneales provenientes de los ratones C57BL/6 desensibilizados puede modificar la respuesta de estas células ante la infección con T. cruzi como así también la producción de los mediadores ya enunciados.

Materiales y Métodos

Animales y Parásitos: Se utilizaron ratones C57BL/6 y BALB/c de 60 a 90 días de edad. En cuanto a T. cruzi, se empleó la cepa Tulahuén, mantenida en ratones CBi de 21 días de edad, mediante inoculación subcutánea de 3.105 parásitos cada 7 días. A partir de sangre obtenida de estos ratones a los 8 días post-infección, se obtuvieron las suspensiones de parásito para cultivo. La sangre heparinizada se diluyó en solución fisiológica y se centrifugó a 500g durante 10 min. Se recolectó el sobrenadante, el cual se centrifugó a 1.200g durante 15 min y luego el precipitado fue resuspendido y centrifugado nuevamente. El recuento de parásitos vivos se realizó en cámara de Neubauer.

Obtención de Células de Exudado Peritoneal: Los animales fueron sacrificados por dislocación y luego inmovilizados en una tabla de disección, con el abdomen hacia arriba. Se retiró la piel abdominal, previo lavado con etanol 70% y se realizó un corte en la pared del peritoneo. Posteriormente se llenó la cavidad con 4 ml de medio de cultivo. Luego se retiró el líquido, recogiéndose en tubos de plástico no adherentes a células (Nunc poliestireno). Las suspensiones celulares obtenidas se centrifugaron a 500g durante 15 min, se resuspendieron en 2 ml de medio de cultivo y luego se determinó su concentración y viabilidad con Azul Tripán (iguales volúmenes de Azul Tripán 0,5% P/V y NaCl 4,25 % P/V) en cámara de Neubauer.

Caracterización de las Células de Exudado Peritoneal

• Adherencia: Los Mf poseen la característica de adherirse al vidrio y a algunos plásticos especiales, utilizándose esta capacidad para separarlas de otras células que pudiesen estar presentes en el líquido de lavado peritoneal. A todos los cultivos se los expuso a una fase previa de adherencia y posterior lavado con medio de cultivo, antes de ser enfrentados al parásito.
• Morfología: Los Mf presentan dos formas principales, las que se evaluaron por examen al microscopio óptico invertido, a diferentes tiempos de cultivo: a) células estrelladas, con extensiones podiformes, cuya proporción aumenta con el tiempo en cultivo; b) células redondeadas. Estas formas son intercambiables y no implican dos poblaciones celulares diferentes.
• Reacción de la esterasa: Los preparados se fijaron en vapores de formol y posteriormente se lavaron con agua destilada, se cubrieron con sustrato revelador (20 mg de a -naftilacetato, 0.32 ml de acetona, 20 ml de buffer fosfato 0.1M pH 7.4, 20 mg de Fast Blue BB) y se incubaron a 37 ºC durante 30 min. Se realizó otro lavado con agua destilada y luego la contra-coloración con verde de metilo al 1% durante 10 min. Luego de lavar con agua destilada se secaron al aire. Los preparados fueron de dos tipos: preparados frescos por extensión de una gota de una suspensión concentrada de células de exudado peritoneal (CEPs) y preparados de células adherentes (3.105 células/pocillo), cultivadas 24 hs en placas de cultivo para miscroscopía óptica (LabTekÒ ChamberSlideä System, Nunc). Como control negativo se utilizó un extendido de sangre normal y como control positivo un cultivo primario de fibrosarcoma SE-100 de rata que normalmente contiene un gran número de Mf infiltrados.

Cultivo de Macrófagos Peritoneales Murinos: Una vez obtenidas las CEPs, se sembraron 1.105 y 3.105 células (provenientes de ratones normales y de ambas cepas) y 3.105 células (provenientes de ratones C57BL/6 normales y desensibilizados) en medio completo (Earle´s MEM (PAA), 10% de SFB (Bioser), 20 m g/ml de gentamicina (Gibco) y 0,4 mM de 2-mercaptoetanol), en placas de 12 pocillos (Nunc) o en placas especiales para microscopía óptica de 8 pocillos (LabTek ChamberSlideÔ Nunc), las cuales se incubaron 2 hs a 37ºC en atmósfera de CO2 al 5%. Posteriormente, se realizaron dos lavados con medio de cultivo a fin de retirar las células no adherentes. A partir de ese momento las células adherentes se denominaron Mf peritoneales. La infección de los cultivos se llevó a cabo en relación Mf :Parásito 1:1(Mf :P 1:1). Los preparados utilizados en microscopía de inmunofluorescencia (IF) –para determinar el número de amastigotes– se fijaron en etanol 100% y se almacenaron a 4ºC. En los experimentos de reversión de la desensibilización se agregó 750 U/ml.pozo de IFNg mr (PrepoTech Inc).

Desensibilización in vivo con LPS y Ptx

Durante cuatro días consecutivos se inocularon ratones C57BL/6, en forma intraperitoneal con Ptx (2 mg/ratón,Trental-Hoechst) y LPS (2 m g/ratón, E. coli serotipo O111:B4, Sigma). Al quinto día se inoculó sólo LPS (200 m g/ratón). Al octavo día de comenzado el tratamiento, los ratones se sacrificaron por dislocación, obteniéndose las CEPs mediante el método antes descripto.

Recuento de Tripomastigotes en Sobrenadante de cultivo de macrófagos peritoneales murinos: Tras 2, 4, 24 y 48 hs de cultivo post-infección y a partir de una alícuota del sobrenadante (SN) se realizó el recuento de parásitos en cámara de Neubauer. En paralelo y bajo las mismas condiciones, se realizaron cultivos de suspensiones de parásitos en ausencia de Mf peritoneales como control de viabilidad.

Detección de Amastigotes por Inmunofluorescencia: El sustrato (cultivo de Mf peritoneales) se recubrió con un pool de sueros de pacientes infectados con T. cruzi (dilución 1/30) e incubados 30 min en cámara húmeda. Luego se efectuaron tres lavados con PBS (10X, Na2HPO4.12H2O 26.5 g/l, NaH2PO4.2H2O 3.6 g/l, NaCl 81.7 g/l, pH 7.2). Posteriormente se cubrieron los portaobjetos con anti-Ig humana de cabra conjugada a FITC en dilución 1/450 (Sanofi Diagnostics Pasteur) durante 30 min en cámara húmeda y al abrigo de la luz. Se efectuaron tres nuevos lavados con PBS y a continuación se cubrió el portaobjetos con Azul de Evans (dilución 1/150) durante 5 min. Luego se realizó un último lavado con PBS y se prosiguió al montaje con glicerina.

Determinación de la producción de Óxido Nítrico como Nitrito: Se extrajo el SN de los cultivos y se los almacenó a –20ºC. La generación de NO por los Mf fue determinada como nitrito usando el reactivo colorimétrico de Griess (volúmenes iguales de sulfanilamida 1% P/V en ácido acético al 30% y naftietilendiamina 0.1% P/V en ácido acético al 60%), el cual permite cuantificar directamente nitrito determinando su absorbancia a 540 nm. La lectura se realizó en un lector de placas de Elisa (Microwell System Reader, Organon Teknika). La determinación de nitrito total (nitrato reducido sumado al nitrito ya presente en la muestra) se realizó mediante la reducción enzimática del nitrato a nitrito, llevada a cabo por la actividad nitrato reductasa presente en bacterias Pseudomonas Oleovorans (cepa ATCC 8062). Alícuotas de 100 m l de los SN fueron incubados con 100 m l de la suspensión de bacterias (diluidas 1/10 en Earle´s MEM) durante 90 min a 37ºC y posteriormente centrifugados a 300g durante 15 min. Se tomaron 100 m l del SN, a los cuales se los sometió al método de Griess. Idéntico tratamiento se realizó con una curva estándar de NaNO3 (5 a 200 m M). Las distintas diluciones de la curva estándar se prepararon en Earle´s MEM a partir de una solución madre de 100mM. Como controles negativos se utilizaron SN de cultivo de Mf peritoneales sin infectar y SN de cultivo de parásitos incubados en ausencia de Mf peritoneales. Los resultados obtenidos se expresaron en m M de nitrito.

El cultivo de Pseudomonas Oleovorans se llevó a cabo a partir de una alícuota de un cultivo mantenido en nuestro cepario. Esta alícuota, se cultivó en 500 ml de medio Luria Bertani (peptona 10g/l, estracto de levadura 5 g/l, NaCl 5 g/l, pH 7) durante 18 hs a 25 ºC en baño termostatizado. El cultivo se centrifugó a 300g durante 15 min a 4 ºC. Se descartó el SN y el precipitado se resuspendió 3 veces en PBS (NaCl 80 g/l, KCl 2g/l, Na2HPO4.7H2O 11.5 g/l, NaH2PO4 2 g/l) seguido de centrifugaciones a 300g durante 15 min a 4 ºC. Luego las bacterias fueron resuspendidas en medio Earle´s MEM con 10 % de glicerol a una concentración de 0,1 g/ml y almacenadas a -70ºC hasta su uso.

Determinación de la producción de Factor de Necrosis Tumoral a e Interleuquinas 1b y 10: Las citoquinas fueron estimadas en los SN a distintos tiempos post-infección. Los controles realizados fueron SN de cultivo de Mf peritoneales en ausencia de parásitos y SN de cultivo de parásitos incubados en ausencia de Mf peritoneales. El dosaje se realizó mediante la técnica de ELISA, según las instrucciones del fabricante (Quantikine M, R&D). Límites de detección: FNTa 5.1 pg/ml, IL-1b 3 pg/ml, IL-10 4 pg/ml.

Purificación de ARN total y transcripción reversa: Se cultivaron 3.106 CEPs provenientes de ratones C57BL/6 normales y desensibilizados durante 2 hs en placas de Petri (Nunc). Luego se infectaron los Mf peritoneales con parásitos en relación Mf :P 1:1. Luego de 1 h post-infección, se realizó un lavado con 0,5 ml de PBS con el fin de eliminar los parásitos y posteriormente las células fueron lisadas con TRIzol (Gibco). En forma resumida, el ARN total se extrajo como se explica a continuación. Se agregaron 3 ml de TRIzol (solución de fenol y tiocianato de guanidina) por placa de Petri, dejándolo actuar durante 5 min a 20 ºC. A continuación se levantó el lisado y posteriormente se agregaron 0,2 ml de cloroformo por cada ml de lisado celular. Luego de vorterear y centrifugar (15 min a 12.000g) se transfirió la fase acuosa y se precipitó el ARN con isopropanol (0.5 ml/ml de lisado celular) durante 10 min a temperatura ambiente. Luego se centrifugó 10 min a 12.000g. El ARN así extraído, se lavó 2 veces con 1 ml de etanol 70%, se centrifugó (10 min a 12.000g), se secó y se redisolvió en 20 m l de agua destilada. Luego de cuantificar la concentración del ARN recuperado por absorbancia diferencial a 260 y 280 nm, se lo diluyó y repartió en alícuotas de 10 m l y así fue conservado hasta el momento de su uso. Cada vez que se realizó una extracción de ARN, la integridad del mismo se verificó por electroforesis en minigel (se sembró 1 m l de la solución de ARN en un minigel de agarosa al 1% en 3 ml de buffer MOPS 10X, 27 ml de formaldehido 2.2M y 1 m l de bromuro de etidio durante 30 min a 80 V).

El ADNc simple hebra se sintetizó a partir del ARN total usando la transcriptasa reversa del virus Moloney de la leucemia murina (SuperScriptä II-Rnasa H--Transcriptasa Reversa- Gibco) y oligo-dT (Gibco) como primers. Brevemente, 10 m g de ARN fueron incubados durante 5 min a 65ºC junto a 1 m l de oligo-dT (50m g/ml). Luego se agregaron 2 m l de dNTP (Promega), 10 m l de buffer First Strand 5X (Gibco), 5 m l de DTT 0.05M (Gibco), 1 m l de inhibidor de RNAsa (RNAsaOUT, Gibco), agua destilada (cantidad necesaria para llevar a volumen final 50 m l ) y 1 m l de Transcriptasa Reversa.

Los tubos se colocaron en un baño a 42 ºC durante 60 min para permitir la reacción de elongación. Posteriormente se colocaron a 70 ºC durante 15 min para desnaturalizar la enzima. Los tubos se almacenaron a -20 ºC para su posterior amplificación por PCR.

Cuantificación de la expresión del ARNm del Factor de Necrosis Tumoral a y de b -actina por PCR: La mezcla de reacción estaba compuesta por 1 m l de ADNc simple hebra, 5 m l de buffer PCR 10X (Gibco), 4 m l de MgCl2 10 mM, 1 m l de dNTP 10 mM (Promega), 1 m l de primer "sentido" de b -actina o FNTa (20 m M), 1m l de primer "antisentido" de b -actina o FNTa (20 m M) y 1 m l de Taq ADN Polimerasa 5 UI/m l (Gibco), completándose a 50 m l con agua destilada para PCR. La amplificación en termociclador se realizó de acuerdo al siguiente programa: desnaturalización inicial a 94ºC (1 min), hibridización a 55ºC (1 min) y extensión a 72ºC (1 min) en un total de 35 ciclos. La extensión final se realizó durante 10 min a 72ºC.

Los primers usados para el FNTa (Bio-Synthesis) y para b -actina (Genset Oligos) fueron:

FNTa : sentido 5´GTT CTA TGG CCC AGA CCC TCA CA 3´

antisentido 5´ TCC CAG GTA TAT GGG CTC ATA CC 3´

b -actina : sentido 5´ GGT GAC GAG GCC CAG AGC AAG 3´

antisentido 5´ GAT CCA CAT CTG CTG GAA GGT 3´

La cuantificación de la expresión del gen del FNTa se llevó a cabo luego de la coamplificación y normalización con el control interno de b -actina. El nivel de expresión de los transcriptos de FNTa fue evaluado –mediante electroforesis en agarosa y tinción con bromuro de etidio– por scanning densitométrico usando una cámara de video y posterior análisis con el programa GELPRO 32.

Análisis estadístico Los resultados se expresan como mediana y rango. En todos los experimentos se trabajó con un n mayor o igual a 4 y corresponden a un experimento representativo de al menos dos realizados en forma independiente. Los datos se analizaron por medio del análisis de la variancia de Kruskal-Wallis y por el testde la U de Mann-Whitney. Las muestras se consideraron distintas cuando el nivel de significación alcanzó como máximo el 5%.

Resultados

• Caracterización de las Células de Exudado Peritoneal:

La viabilidad de las suspensiones de CEPs utilizadas fue siempre mayor al 98%. En cuanto a la morfología, los Mf peritoneales obtenidos a partir de animales desensibilizados, alcanzaban rápidamente la forma estrellada. En los Mf peritoneales obtenidos a partir de ratones normales se observaron en las primeras 12 hs formas redondeadas, las cuales luego adquirieron la forma estrellada típica de los Mf en cultivo. La reacción de la esterasa mostró que el 98% de las CEPs recién extraídas eran Mf y el 100% luego de 24 hs de incubación, tanto en los exudados extraídos de animales normales, como en los de desensibilizados.

Como puede observarse en laFigura 2, en ambos tipos se reconocen depósitos citoplasmáticos marrón oscuro característicos del sustrato coloreado.

1. El estudio de las diferencias en la susceptibilidad ante la infección in vitro con T. cruzi en Mf peritoneales de las cepas C57BL/6 y BALB/c, arrojó los siguientes resultados:

   Recuento de Tripomastigotes en el Sobrenadante:

   El recuento de parásitos a 2, 4, 24 y 48 hs post-infección no presentó diferencias entre grupos en cuanto a la desaparición de tripomastigotes en el SN (relación Mf /P 1:1). Tabla I.

   Los valores obtenidos en el recuento de parásitos incubados en ausencia de Mf fue mayor en todos los casos y sin diferencias significativas entre grupos (No se muestran datos).

   Recuento de Amastigotes por Inmunofluorescencia:

   El recuento de parásitos intracelulares se realizó a las 2, 4 , 24 y 48 hs post-infección (relación Mf :P 1:1). Al igual que lo ocurrido con el recuento de parásitos en el SN, no se observaron diferencias significativas entre ambas cepas.Tabla II.

   En la Figura 3 se aprecian los amastigotes en color amarillo y los Mf en rojo.

   Producción de mediadores

   Se determinó la cantidad de nitrito total en los SN de cultivo correspondientes a las 48 hs post-infección. Independientemente de la cepa de ratón, no se obtuvieron niveles apreciables de nitrito cuando la cantidad de células cultivadas fue de 1.105/pocillo. Sin embargo cuando se cultivaron 3.105/pocillo, sí se observó la presencia de nitrito, no obteniéndose diferencias significativas entre grupos. A las 48 hs post-infección se advirtieron niveles apreciables de FNTa en los cultivos de Mf peritoneales (3.105/pocillo) procedentes de ratones C57BL/6, siendo estos significativamente mayores con respecto a los de BALB/c. Figura 4.

2. Con respecto a si el protocolo de desensibilización in vivo con LPS y Ptx en ratones C57BL/6 era capaz de modificar las características de la infección in vitro con T. cruzi de los Mf peritoneales en cuanto a replicación parasitaria y producción de mediadores, obtuvimos los siguientes resultados:

Recuento de Tripomastigotes en el Sobrenadante:

El recuento de parásitos en el SN se realizó a 24 y 48 hs post-infección. No se presentaron diferencias entre los cultivos de Mf procedentes de ratones normales (C57Bl/6) o desensibilizados (DES) en cuanto a la desaparición de parásitos en el SN a los distintos tiempos post-infección. En la Tabla III se observan los datos obtenidos a partir de la relación Mf :P 1:1 en los distintos tiempos post-infección.

Recuento de Amastigotes por Inmunofluorescencia:

El número de amastigotes presentes en los Mf procedentes de los animales desensibilizados (DES) fue significativamente mayor, tanto a 24 como a 48 hs, con respecto a los no desensibilizados. Tabla IV.

Producción de mediadores:

Se determinó la cantidad de nitrito total en los SN de cultivo de los Mf procedentes de los ratones normales y desensibilizados a las 24 y 48 hs post-infección, no obteniéndose diferencias significativas. No se detectaron niveles apreciables de nitrito en los Mf no infectados, provenientes de ratones tratados o sin tratar.

En cuanto al nivel de FNTa , se observó una disminución significativa en los SN de DES, tanto en los infectados como en los sin infectar, con respecto a los no tratados. Esta diferencia si bien era marcada a las 24 hs (no se muestran datos), se acentuó a las 48 hs post-infección.

En cuanto a los resultados obtenidos con respecto al nivel de secreción de IL-1b observamos que sigue el mismo patrón de secreción que el FNTa , es decir, sus niveles se hallan reducidos significativamente en los SN de DES –con respecto a los no tratados– en los grupos infectados. No se observaron diferencias significativas entre grupos no infectados.

Con respecto al nivel de IL-10, éste fue marcadamente mayor en el grupo DES, tanto a 24 (no se muestran datos) como a 48 hs, tanto en los infectados como en no infectados. Figura 5.

Expresión del ARNm de FNTa inducida por T. cruzi en macrófagos provenientes de ratones normales y desensibilizados con LPS y Ptx

Numerosos trabajos muestran que en el estado de tolerancia al LPS la expresión de FNTa a nivel transcripcional se halla disminuida. A pesar de que los mecanismos de supresión propuestos varían de un modelo a otro, el más aceptado es el de supresión a nivel transcripcional. Estos resultados se informaron en células RAW 264.7 (línea macrofágica murina), Mf peritoneales de conejo, monocitos y Mf peritoneales humanos entre otras.27 Habiendo obtenido una disminución significativa de este mediador en los SN correspondientes a los ratones desensibilizados con LPS y Ptx, decidimos investigar la expresión a nivel transcripcional del FNTa en la primera hora post-infección. Para ello, los Mf provenientes de ratones normales y desensibilizados se incubaron 1 h en medio de cultivo (fase de adherencia) y luego fueron infectados en una relación Mf :P 1:1. La obtención de los ARN se hizo una hora más tarde. Luego de 1 h de exposición al parásito la expresión del ARNm del FNTa se vio notablemente incrementada en C57BL/6 con respecto a DES. Esto muestra que los Mf provenientes de los ratones desensibilizados son más refractarios ante un nuevo estímulo como lo es la infección con T. cruzi, no alterando sustancialmente el nivel basal de expresión del ARNm del FNTa . Figura 6.

3. Dado los efectos del IFNg sobre la funcionalidad de los Mf , decidimos analizar si dicha citoquina podía modificar la respuesta parasiticida de los Mf desensibilizados con LPS y Ptx. Esto podría indicar el grado en el que estas células modificaron su comportamiento, en términos de respuesta a la infección in vitro con T. cruzi. Los resultados obtenidos fueron los siguientes:

Recuento de Parásitos en el Sobrenadante y de Amastigotes por Inmunofluorescencia:

El agregado de IFNg en cultivos de C57BL/6 (C57BL/6+IFN) y DES (DES+IFN) infectados in vitro con T. cruzi, mostró una disminución significativa en ambos tipos de cultivos a las 48 hs post-infección, con respecto a aquellos (C57BL/6 y DES) a los cuales no se agregó este mediador, tanto en el número de tripomastigotes como amastigotes. Tabla V.

Producción de mediadores en los SN estimulados con Interferón Gamma:

En los cultivos de Mf DES a los cuales se los estimuló con IFNg ( DES+IFN) en presencia del parásito, se presentó un aumento significativo en el nivel de FNTa, IL-1b y nitritos, como también una disminución en los niveles de IL-10, con respecto a los no estimulados (DES), a las 48 hs post-infección. Figura 7.

Discusión

Las cepas murinas BALB/c y C57BL/6 son ampliamente utilizadas como modelos experimentales de susceptibilidad o resistencia ante una serie de diversos patógenos intracelulares, por ejemplo, micobacterias, leishmanias o listerias.28 Dado que T. cruzi es un parásito intracelular, dichas cepas también han sido empleadas en estudios experimentales sobre esta tripanosomiasis.

Los trabajos previos de nuestro laboratorio muestran que la infección experimental con T. cruzi en dos cepas murinas de diferente susceptibilidad ofrecen un excelente modelo para investigar la resistencia natural durante la fase aguda. La inoculación de tripomastigotes de la cepa Tulahuén de T. cruzi en ratones BALB/c y C57BL/6 produjo en ambos grupos una enfermedad aguda caracterizada por parasitemias bien evidentes, infiltrados inflamatorios y pérdida de timocitos. Los ratones C57BL/6 mostraban una enfermedad progresiva y letal, mientras que los BALB/c se recuperaban de la fase aguda.16

Con el propósito de investigar los diferentes mecanismos que permiten al huésped controlar la infección aguda y para una mejor caracterización de estos modelos, inicialmente se indujo la infección in vitro en los Mf peritoneales, para determinar el número de parásitos extra e intracelulares como así también los mediadores, potencialmente involucrados en la respuesta antiparasitaria, en los SN de cultivo.

Los Mf presentan un rol dual en la infección con T. cruzi. Estas células pueden permitir la replicación del parásito o bien participar en su eliminación, dependiendo del grado de activación que hayan adquirido. La desaparición de parásitos del SN puede interpretarse como un reflejo de la capacidad fagocítica de estas células y quizás también de su potencialidad para eliminar el parásito en forma extracelular mediante la secreción de compuestos tripanomicidas.

La elección de los mediadores a evaluar se basó en evidencias que involucran al NO, el FNTa , IL-1b e IL-10, como elementos fundamentales para la resolución de la infección.10-29 El NO es un metabolito esencial en la resistencia contra el T. cruzi, pero un exceso en su producción puede provocar inflamación y daño tisular.30 Dado que la síntesis de NO es estimulada por FNTa e inhibida por IL-10,9 su producción podría relacionarse con la gravedad de la enfermedad aguda. En nuestro caso no se observaron diferencias in vitro entre los ratones C57BL/6 y BALB/c con respecto a los metabolitos del NO, probablemente debido al corto tiempo de exposición de los Mf al parásito. Estos resultados coinciden con los datos obtenidos por Roggero y col., dado que al día 7 post-infección no se constataron diferencias entre ambas cepas en los niveles séricos de este mediador. Aunque en el estudio in vivo se observó un aumento paulatino de NO a medida que avanzaba la fase aguda de la enfermedad siendo significativamente superior en la cepa C57BL/6 al día 21 post-infección.17 La producción de FNTa se puede inducir por la exposición del huésped a microorganismos como bacterias, hongos, levaduras, virus y parásitos. Incluso puede desencadenarse su liberación ante el contacto con LPS.31 Ante la infección con T. cruzi in vitro, otros autores habían detectado un aumento en los niveles de ARNm del FNTa , seguido de la posterior liberación de este mediador.32 Si bien el rol exacto del FNTa en esta tripanosomiasis no está totalmente esclarecido, varios estudios mostraron que tiene tanto efectos nocivos como protectores.33 Así, los estudios en ratones susceptibles al T. cruzi donde se los trata con FNTa murino recombinante indican que el tratamiento es capaz de reducir la replicación del parásito dentro de los Mf , no obstante que produce un aumento en la mortalidad de los animales.34 Dado que los Mf peritoneales de ambas cepas no presentaron diferencias en cuanto a la replicación del T. cruzi, la mayor severidad de la infección sistémica en los animales C57BL/6 bien podría estar asociada con los mayores niveles de FNTa y no con la carga parasitaria. Esto coincide con lo observado por otros autores en cuanto a que no existen diferencias en la proliferación intracelular de T. cruzi en ratones de distinta susceptibilidad infectados por la misma cepa,35 si bien se presentan diferencias en cuanto a la interiorización y multiplicación cuando la infección se produce con cepas distintas del parásito.36 Por otra parte, los niveles más elevados de FNTa en el SN de cultivo de los ratones C57BL/6 coinciden con los resultados que se obtuvieron al dosar las concentraciones de esta citoquina a nivel sistémico.16

Una vez caracterizados ambos modelos experimentales y dado que la mayor susceptibilidad a la infección de los ratones C57BL/6 se correlacionaba con niveles aumentados de FNTa , nuestro próximo paso fue intentar disminuir el nivel de esta citoquina. Con este propósito, se diseñó un modelo experimental cuya finalidad era modificar la respuesta inmunológica excesiva que generaban los ratones C57BL/6 ante la infección con T. cruzi.

Basándonos en que la superficie de T. cruzi presenta estructuras símil LPS 37, 38 y teniendo en cuenta que el pretramiento con dosis bajas de LPS induce un estado de hiporespuesta al desafío con LPS, se decidió explorar la influencia de la tolerización al LPS sobre las características de la infección in vitro. Dado que los cambios más favorables sobre el curso de la enfermedad aguda se lograron cuando al protocolo de tolerancia se le agregaba Ptx, nuestro estudio in vitro se focalizó a analizar los cambios que podían sucederse en los Mf cuando eran expuestos al parásito. Los resultados indican que dicha inmunointervención logró descender el nivel del FNTa en el SN de Mf peritoneales infectados. Del mismo modo, se detectó una disminución a nivel transcripcional en la primera hora post-infección. La inhibición en la expresión para esta citoquina por los Mf peritoneales guardaba similitud con lo observado a nivel sistémico en los ratones tolerizados. En un trabajo reciente, Ropert y col. muestran un efecto similar producido por la "tolerización cruzada" entre LPS y una molécula símil LPS de la cubierta del parásito, sobre la expresión de citoquinas inflamatorias por parte de los Mf de la cepa C57BL/6.25

El tratamiento de desensibilización con LPS y Ptx moduló la actividad de los Mf , a modo tal de evitar una producción excesiva de FNTa . El recuento de amastigotes en Mf provenientes de animales desensibilizados mostró un aumento en el número de parásitos con respecto a los controles. Esto se explicaría por la disminución de FNTa , como así también por el aumento en los niveles de IL-10, dado que la misma es capaz de inactivar los mecanismos efectores del Mf , tornando a las células más permisivas a la replicación de los parásitos. A la par de estos comentarios, es necesario considerar que algunos estudios indican que la presencia de IL-10 tiene un efecto beneficioso en las infecciones experimentales con T. cruzi, como parte de un mecanismo que contrarresta la respuesta inflamatoria.39 Por otro lado, las investigaciones en donde la infección experimental con T. cruzi se produce en ratones deficientes en esta citoquina, muestran una alta mortalidad.40

Los cambios de IL-1b en los SN de Mf peritoneales reprodujeron lo ocurrido con el FNTa . En animales desensibilizados e infectados con el parásito, el nivel de esta citoquina cae por debajo de los valores observados en los controles.

El efecto inhibitorio de la desensibilización al LPS sobre la producción de FNTa parece estar relacionado con un aumento en la transcripción del homodímero p50/p50 del NF-k B. Dado que NF-k B participa en la regulación de una gran cantidad de mediadores proinflamatorios, es probable que la disminución de la producción de IL-1b se deba a una mecanismo similar.41

Con respecto al NO, los valores obtenidos fueron similares en ambos grupos. Es sabido que el gen de la NOSi se halla entre aquellos capaces de ser regulados por el factor transcripcional NF-k B. La NOSi es activada transcripcionalmente en respuesta al LPS y al IFNg y su transcripción es inhibida por un mecanismo de retroalimentación en el que también interviene el NF-k B.42 Si bien hay trabajos que informan una disminución de NO en el estado tolerante,27, 42 esto no se observó en nuestro modelo. En concordancia con nuestros resultados, Ropert y col. no encontraron disminución de la síntesis de NO en el estado tolerante inducido tanto por LPS como por una molécula símil LPS de la cubierta del parásito.25 Con respecto a los estudios de reversión de la desensibilización, se vio claramente que el agregado de IFNg aumentó significativamente la desaparición de los parásitos del SN como así también las formas intracelulares. Asimismo se produjo un aumento significativo en el nivel de mediadores capaces de activar al Mf. En efecto, los niveles de nitrito aumentaron significativamente y a un nivel similar en los dos grupos tratados con IFNg (C57BL/6+IFNg y DES+IFNg ), respecto de los grupos no tratados.

Ante el agragado de IFNg a los cultivos de Mf de ratones desensibilizados, se observó un aumento en los niveles de FNTa, como así también de IL-1b, conjuntamente con una disminución en los niveles de IL-10. Sin embargo, los niveles de los mediadores activadores no alcanzaron el valor registrado en el grupo C57BL/6+IFNg . Estos resultados nos llevan a concluir que la disminución observada en el numero de parásitos, en los grupos tratados con IFNg , tanto extra como intracelulares, se debería mas bien a la presencia de NO.

Todo lo expuesto refuerza nuestra hipótesis de que el estado de desensibilización inducido por LPS y Ptx produce un cambio en la respuesta de los Mf ante la infección. Este cambio se traduce en una modificación en el patrón de secreción de citoquinas, promoviendo un predominio de mediadores antinflamatorios que de este modo evitaría un daño excesivo al huésped.

(Recibido: abril de 2003. Aceptado: junio de 2003)

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La Foto Histórica

AEROPUERTOS.

EL DR. ARGONZ Y EL ÉXODO DE LOS CIENTÍFICOS ARGENTINOS

En la fotografía que ilustra este comentario puede observarse al Dr. Víctor E. Argonz en un aeropuerto. Desconozco de cuál se trata pues el dato no me fue revelado y en la imagen no hay detalles identificables más que un avión y valijas, objetos comunes a cualquier lugar de ese tipo.

Cuando este retrato llegó a mis manos, me encontraba aún conmovido por una información que no es noticia. Pues se trata de un fenómeno crónico y creciente: el éxodo de científicos desde nuestro país. El comentario en cuestión estaba ilustrado también, por un aeropuerto, pero en ese caso sin personaje visible. Acaso, los protagonistas son una inmensa cantidad de jóvenes altamente capacitados, a los que se invita a irse desde hace ya algo más de medio siglo y que ha crecido últimamente. Podría afirmarse incluso, a la luz de la información, que dentro de los planes de un científico luego de su formación y graduación, se halla buscar un sitio en el mundo donde ir a trabajar en su disciplina.

Víctor Emilio Argonz nació en Rosario el 6 de diciembre de 1919. Tocaba su fin el año de la creación de la Facultad de Ciencias Médicas, Farmacia y Ramos Menores en nuestra ciudad.

En efecto, el Congreso de la Nación había debatido y aprobado la creación de la Universidad Nacional del Litoral, promulgada el 17 de octubre de ese año, por Ley 10.861 del P.E. presidido por Hipólito Yrigoyen.

En esa casa de altos estudios Argonz se graduó de médico cirujano el 11 de mayo de 1946, un año cargado de acontecimientos fundamentales para la nación. El 27 de noviembre de 1964, en la misma Casa, recibió su título de Doctor en Medicina.

Como docente ocupó los cargos de ayudante, jefe de trabajos prácticos, residente, jefe de residentes, hasta alcanzar el de Profesor Adjunto de Cirugía. Fue encargado de la Cátedra de Clínica Quirúrgica del Hospital Fernández (actual Hospital Eva Perón de Granadero Baigorria) entre los años 1968 y 1970; en 1977 pasó a ser encargado de la Unidad Docente Hospitalaria de Clínica Quirúrgica del Hospital Clemente Álvarez. De 1978 a 1981 integró la Comisión de Investigaciones Científicas y Técnicas de la Facultad de Ciencias Médicas de la UNR.1

Concurrió en numerosas oportunidades a realizar diversas actividades profesionales en el extranjero; quizás a alguno de esos viajes corresponda la nota gráfica aquí incluida.

Al ver la simpática fotografía un colega me comentó: "a Argonz, que era oncocirujano, lo conocí personalmente como jefe de la unidad docente de Cirugía del Hospital Clemente Álvarez, donde cursé Clínica Quirúrgica. Además, estaba en el Sanatorio Británico cuando comencé a trabajar allí. Por el 88 u 89 fue sometido a una cirugía cardíaca en Buenos Aires, por el Dr. René Favaloro. Vez pasada me encontré con la esposa y con el hijo y cuando les mencioné estas cosas que me acordaba de él, se asombraron de mi memoria. Era muy serio y muy digno."

El Dr. Argonz falleció el 13 de abril de 1990, mientras estaba de vacaciones fuera de la ciudad, por una complicación de su enfermedad. 

La mención del Dr. Favaloro trae a colación la trágica circunstancia en que culminó sus días, acaso un matiz dentro del panorama de desatención, desaliento o la eliminación deliberada de la actividad científica en Argentina. Víctima de la incomprensión y cansado de reclamar en los despachos gubernamentales una deuda que ponía en serias dificultades a su obra, decidió poner punto final a su vida con un disparo en el corazón a los 77 años.2 "En este último tiempo me he transformado en un mendigo. Mi tarea es golpear puertas para recaudar algún dinero que nos permita seguir con nuestra obra. La mayoría de las veces ni los empleados de baja categoría contestan mis llamados", habría manifestado al justificar, si hacía falta, su determinación.

En la primavera del año en que Argonz recibía su título de médico, Bernardo A. Houssay era exonerado de su cátedra en la Facultad de Medicina de Buenos Aires. ¿Quién puede ignorar el relevante papel que jugó Houssay defendiendo y promocionando la actividad científica en nuestro país?3 Su trabajo para evitar el éxodo fue inmenso, sin embargo hoy como entonces, podemos tristemente leer "noticias" que dan cuenta que la tendencia de los científicos argentinos es emigrar.

Una encuesta desarrollada por la Universidad de Morón indica que 80% de los estudiantes que actualmente cursan distintos doctorados en ciencias experimentales de las universidades públicas piensan en ir a trabajar al exterior, antes que enfrentar circunstancias adversas en el país, tanto en el plano profesional como personal. Y piensan de tal modo tanto los que recién comienzan la carrera como los que se encuentran escribiendo su tesis doctoral.
El investigador que dirigió el trabajo "Expectativas laborales de los alumnos y egresados de la carrera de doctorado en las áreas de ciencias exactas y naturales, ingeniería y tecnología" aseguró que "el sistema permite que una persona estudie, se forme, vaya a al extranjero y se quede allá. Y de esta forma el sistema está perdiendo sus investigadores, además de su dinero y sus inversiones."
Los resultados del trabajo muestran que 46% de los estudiantes de doctorado persiguen objetivos de formación o logro personal, y que el resto (54%) ve en el doctorado una etapa en su carrera laboral, ya sea para irse al exterior o para tener más o mejores posibilidades laborales.
De estos estudiantes que piensan ir al extranjero, 23% "ya tiene decidido no regresar al país," mientras que un 57% tomará su decisión a partir de las diferencias que encuentre entre vivir en el exterior y en la Argentina.4

Días después un funcionario del Conicet señaló que "si bien el proceso de emigración a los países desarrollados es generalizado, Argentina sobresale entre los primeros."5 "En el proceso de emigración se destacan tres tendencias: un alto porcentaje de profesionales técnicos sobre el conjunto de los que emigran; de este conjunto, un alto porcentaje de científicos, y el proceso de migración de estos científicos se dio de manera sostenida durante la década de los 90 y, en particular, desde 1997."
Datos recabados en los Estados Unidos indican que "en 1999, sólo en ese país había 10.594 científicos y técnicos argentinos (6.218 no activos, y 4.377 activos en investigación y desarrollo), en comparación con los 8.046 de Brasil. Luego de la debacle comenzada en diciembre de 2001, y en la actualidad, se manejan cifras que demuestran que se duplicaron los intentos por emigrar por parte de los científicos y técnicos argentinos."
Un comentario editorial posterior señalaba que la tendencia instalada en el mundo es valorar el conocimiento como el más preciado de los bienes de cambio.6 No pocos hombres de ciencia han dicho eso en nuestro país, desde fines del siglo XIX. Sin embargo, no fueron escuchados y si lo han sido, por las razones que fuera se ha hecho caso omiso a sus pronósticos. Los niveles educativos parecen haber descendido y los científicos que se van al exterior son seguidos incluso por jóvenes que aún sin profesión, buscan otros horizontes En otras palabras ya no sólo se trata de personal calificado. El comentario adjudicaba a los jóvenes un "profundo descreimiento sobre el porvenir nacional como la aparente falta de interés en participar del proceso de cambio". Sin embargo, más bien parece que el país no cree en sus científicos y universitarios, y para muestra alcanza con observar qué actividad cultivan quienes manejan espacios de poder. ¿Cuántos científicos hay? ¿A cuántos se les consulta y participa sobre cuestiones relevantes, en las que el aporte de sus trabajos y experiencias sería oportuno?

La amarga impresión es que, de momento, todo continuará por el mismo sendero. El titular de Ciencia, Tecnología e Innovación Productiva (Secyt), creó y puso en funciones hace pocas semanas a la Comisión Asesora del programa Raíces (Red de Argentinos Investigadores y Científicos en el Exterior), con el fin de atender el problema del incremento de la emigración de los investigadores argentinos. ¿Mejorarán las condiciones para que crezca nuestra actividad científica? El funcionario señaló: "hay una gran cantidad de investigadores que se encuentra en distintas ciudades del mundo y como no podemos traerlos de regreso a la Argentina, al menos debemos procurar aprovecharlos, en el mejor sentido de la palabra."5

El tiempo dirá si las instantáneas de los profesionales en los aeropuertos serán simpáticas notas circunstanciales o continuarán siendo nostálgicas imágenes de despedida del país.

1. Víctor E. Argonz, Antecedentes, títulos, etc. Rosario, 1982.
2. Newsletter FECC. Año 2. Número Especial, 30/7/00.
3. www.nobel.se/medicine/laureates/1947/houssay-bio.html
4. El 80 por ciento de estudiantes de doctorados piensa emigrar. La Capital, Rosario, 20/6/03
5. El gobierno quiere recuperar a científicos que se fueron del país.La Capital, Rosario, 26/7/03
6. Ciencia y país (Editorial). La Capital, Rosario, 28/6/03.

¿EFECTO BENEFICIOSO O PERJUDICIAL DE BILIRRUBINA NO CONJUGADA (BNC) SOBRE EL SISTEMA DEL COMPLEMENTO (C)?*

Sandra M. Arriaga, Aldo D. Mottino, Adriana M. Almará**

Departamento de Bioquímica Clínica. Instituto de Fisiología Experimental. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, UNR. CONICET. CIUNR.

BENEFICIAL OR DAMAGING EFFECT OF UNCONJUGATED BILIRUBIN (UB) ON THE COMPLEMENT (C) SYSTEM?

Summary

1. INTRODUCCIÓN

El sistema del complemento (C) es el principal efector de la respuesta inmune y varios estudios sugieren que está involucrado en numerosos procesos de daño tisular.1 El C puede ser activado a través de dos cascadas enzimáticas interrelacionadas, denominadas vía clásica 2 y vía alternativa.3 Las proteínas de la vía clásica han sido agrupadas en tres unidades funcionales: la unidad de reconocimiento constituída por C1q, C1r y C1s; la unidad de activación representada por C4, C2 y C3; y el complejo de ataque a la membrana, constituido por C5-C9. La activación de la unidad de reconocimiento generalmente se inicia por la interacción de C1q con complejos de IgM o IgG con antígenos.3 Cuando el antígeno está presente sobre la superficie de un glóbulo rojo, la activación in vivo del C puede conducir a hemólisis intravascular.4

Investigaciones recientes indican que la biliverdina (BV), un precursor de la bilirrubina con quien presenta similitud estructural,5 muestra efectos antiinflamatorios y antialérgicos que podrían atribuirse, al menos en parte, a su acción anticomplementaria.6 La conversión de BV a bilirrubina es muy eficiente en el hombre y en la rata. La administración exógena de BV en ratas deriva en su rápida conversión en bilirrubina, la cual aparece rápidamente en bilis bajo la forma de sus conjugados habituales.7 En el hombre y en la rata, aproximadamente el 80% de la bilirrubina deriva de eritrocitos senescentes y el 20% remanente proviene de otras hemoproteínas incluyendo mioglobina, citocromos tisulares, catalasa y peroxidasa.8 Tras su producción en los tejidos periféricos la bilirrubina, unida a la albúmina,9,10 se transporta al hígado donde es captada rápidamente por los hepatocitos y conjugada con ácido glucurónico para producir monoglucurónido y diglucurónido de bilirrubina, que luego se excretan en bilis.11

El aumento de los niveles plasmáticos de bilirrubina no conjugada (BNC) puede producirse como consecuencia de una sobreproducción del pigmento (generalmente ocasionada por una hemólisis incrementada)12 o de una deficiencia en el sistema de conjugación hepático, como en el recién nacido o en algunos desórdenes genéticos.13 Niveles plasmáticos elevados de bilirrubina conjugada pueden observarse cuando existe una lesión del parénquima hepático o una obstrucción de la vía biliar.14, 15 Si bien la acumulación de BNC en los tejidos puede interferir con las funciones normales de la célula debido a su alta afinidad por los dominios enriquecidos en lípidos,16 también se ha propuesto que el pigmento puede ejercer efectos beneficiosos como antioxidante natural.17-20 Sin embargo, a pesar de la frecuencia y de la importancia de varias patologías que cursan con hiperbilirrubinemia, se desconoce el efecto potencial de la bilirrubina sobre el sistema del C.

2. OBJETIVO

El objetivo de este trabajo fue analizar el efecto de bilirrubina sobre el sistema del C invitro e in vivo.

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. REACTIVOS GENERALES

• Albúmina sérica humana libre de ácidos grasos (HSA), albúmina sérica bovina, BNC (predominantemente el isómero IXa ), BV (dihidroclorhidrato), monolaurato de polioxietilensorbitán (Tween 20), IgG humana (grado reactivo), IgM humana (grado reactivo) y antisuero anti-C1q humano desarrollado en cabra (Código C3900) [Sigma; St. Louis, Missouri, EUA].
• antisuero anti-inmunoglobulinas de cabra conjugadas con peroxidasa, desarrollado en conejo (Código P0160) y 3,3´, 5,5´ tetrametilbencidina (TMB) [Dako; Copenhagen, Dinamarca].
• Tiras de poliestireno: (Nunc; Copenhagen, Dinamarca).
• Antisuero anti-eritrocitos de carnero (Código 7 220 2) [Bio-Mérieux, Marcy L’Étoile, Francia].

3.2. SOLUCIONES AMORTIGUADORAS

Solución veronal salina (VBS): NaCl 142 mM, veronal sódico 5 mM, pH 7,4; Solución de Mayer (VBS- Ca2+-Mg2+): VBS, CaCl2 0,15 mM, MgCl2 1mM; Solución VBS- CaCl2 (VBS-Ca2+): VBS, CaCl2 0,15 mM; Solución VBS- Ca2+ - dextrosa (DVBS-Ca2+): VBS-Ca2+, dextrosa 2,5%; Solución de Mayer- dextrosa (DVBS-Ca2+-Mg2+): VBS-Ca2+-Mg2+, dextrosa 2,5%; Solución VBS-EDTA: VBS, EDTA 5mM; Solución de carbonato - bicarbonato: Na2CO3 0,05 M, NaHC03 0,05 M, pH 9,6; Solución salina de fosfatos (PBS): fosfato 10 mM, KCl 2,7 mM, NaCl 137 mM, pH 7,4; Solución de PBS- Tween (PBS-T): PBS, Tween 20 0,05%; Solución de PBS-T- BSA: PBS-T, BSA 1%.

3.3. COMPLEMENTO

Se extrajo sangre sin anticoagulante de dadores con serología negativa (Chagas, Hepatitis B, Hepatitis C, Brucelosis, Sífilis y Virus de la Inmunodeficiencia Humana) del Hospital Provincial del Centenario. Después de conservar las muestras durante 4 hs a 4°C, éstas fueron centrifugadas y la mezcla de sueros obtenida se utilizó como fuente de C.

3.4. SÍNTESIS DEL MONOGLUCURÓNIDO DE BILIRRUBINA (MGB)

El MGB se preparó biosintéticamente a partir de bilis de rata normal, se aisló por cromatografía de adsorción y se purificó por cromatografía en capa delgada.21

3.5. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES DE LOS PIGMENTOS BILIARES

La BNC y la BV se disolvieron en un volumen mínimo de OHNa 0,1 N y luego se diluyeron en VBS o VBS-Ca2+-Mg2+ respectivamente, para obtener una solución stock 342 m M. El MGB se disolvió en VBS-Ca2+-Mg2+. El pH final de todas las soluciones fue de aproximadamente 7,8-8,0. Las concentraciones de los pigmentos biliares en las soluciones correspondientes se determinaron por espectrofotometría directa utilizando una longitud de onda de 450 nm para BNC (e max 61,0 mM-1. cm-1) y MGB (e max 60,0 mM-1. cm-1) y de 650 nm para BV (e max 14,6 mM-1. cm-1).

Todos los procedimientos que utilizaron BNC, MGB y BV se realizaron al abrigo de la luz para minimizar la fotoconversión de bilirrubina en sus fotoisómeros.

3.6. ERITROCITOS DE CARNERO

Sangre de carnero obtenida por punción de la vena yugular y recogida en una solución de citrato-NaCl-dextrosa, fue centrifugada y el plasma sobrenadante, así como la capa de glóbulos blancos, fueron descartados. El sedimento de eritrocitos (E) se lavó 2 veces con NaCl 150 mM, una vez con VBS-Ca2+-Mg2+ y se resuspendió en la misma solución.

3.7. MEZCLA HEMOLÍTICA

Una suspensión de E con 1x109 células/ml (5%) en VBS-Ca2+-Mg2+ se incubó a 37°C durante 15 min con un volumen igual de una dilución 1:1000 de anticuerpos de conejo anti-glóbulos rojos de carnero (A) para obtener eritrocitos sensibilizados (EA).22, 23

3.8. EXPERIMENTOS IN VITRO

3.8.1. ENSAYOS HEMOLÍTICOS

3.8.1.1. EFECTO DE LOS PIGMENTOS BILIARES SOBRE LA ACTIVIDAD HEMOLÍTICA GLOBAL DEL C

Para evaluar el efecto de BNC, MGB y BV sobre la actividad hemolítica del C por la vía clásica, un volumen de una dilución de suero humano como fuente de C, se incubó con un volumen de EA (5x108 células/ml en VBS-Ca2+-Mg2+) y con un volumen de diferentes concentraciones de BNC (1,0; 2,0; 2,5; 3,3 y 5,0 mg/dl), MGB (3,3; 5,0; 7,0 y 10,0 mg/dl) ó BV (1,0; 2,0; 3,3; 5,0 y 10,0 mg/dl) ó con un volumen de VBS-Ca2+-Mg2+ (control) a 37°C durante 60 min. La reacción hemolítica se detuvo por el agregado de una solución fría de NaCl 150 mM. Después de centrifugar durante 5 minutos a 3500 rpm se determinó la absorbancia de los sobrenadantes a 410 nm. El porcentaje de hemólisis se determinó por comparación con la densidad óptica obtenida para un control del 100% de hemólisis preparado con un volumen de EA y dos volúmenes de agua destilada.

La integridad de BNC y de BV en los sobrenadantes al final de la incubación fue verificada por el análisis de sus espectros, en tanto que la de MGB se verificó evaluando la composición de los sobrenadantes en BNC, MGB y diglucurónido de bilirrubina (DGB) por metanólisis alcalina seguida de cromatografía en capa delgada.24

Para determinar la influencia del pretratamiento de los EA con BNC sobre la hemólisis mediada por C, se incubó un volumen de EA (5x108 células/ml en VBS-Ca2+-Mg2+) con un volumen de BNC (5 mg/dl) o de VBS-Ca2+-Mg2+ (control) a 37°C durante 10, 30 y 60 min. Después de lavar las células con VBS-Ca2+- Mg2+ para remover el pigmento, las suspensiones fueron ajustadas a 5x108 células/ml con la misma solución e incubadas con un volumen de una dilución de suero humano como fuente de C durante 60 minutos a 37°C. La hemólisis se evaluó como se describió anteriormente.

Para establecer si la presencia de HSA, transportador fisiológico de BNC, modificaba el efecto del pigmento sobre la hemólisis mediada por C, se incubaron EA, suero humano y diferentes concentraciones de BNC (1,0; 2,0; 2,5; 3,3 y 5,0 mg/dl) con HSA en una concentración final de 25 y 50 mg/ml. La hemólisis se evaluó como se describió anteriormente.

3.8.1.2. EFECTO DE BNC SOBRE LA ACTIVIDAD HEMOLÍTICA DE LOS COMPONENTES INDIVIDUALES DEL C

Se analizó el efecto de BNC sobre la actividad hemolítica de C1, C4, C2 y C-EDTA, el cual involucra la participación de los componentes C3-C9.22, 23

EL efecto de BNC sobre C1 se evaluó por la habilidad de suero humano depletado de C4 (reactivo R4) como fuente de C1, para transformar EA en EAC1 21, 22 en presencia de BNC. Con tal propósito, R4 (suero humano tratado con OHNH4 0,15 N durante 60 min a 37ºC), se incubó con EA (5X108 células/ml en VBS-Ca2+) durante 10 min a 37°C, en ausencia (control del 100% de hemólisis) y presencia de BNC (1,0; 2,5; 3,3; 5,0; 10,0 y 20,0 mg/dl). Después de lavar las células con VBS-Ca2+- Mg2+ para remover el pigmento, las suspensiones fueron ajustadas a 5x108 células/ml en la misma solución e incubadas durante 60 minutos a 37°C con reactivo R1 (suero humano depletado de C1 por precipitación con fosfato de potasio 20 mM). La hemólisis se evaluó como se describió anteriormente. El déficit de C4 en el reactivo R4, se demostró por la ausencia de actividad hemolítica sobre EAC1. El déficit de C1 en el reactivo R1, se demostró por la ausencia de actividad hemolítica sobre EA.

El efecto de BNC sobre C4 se midió por la capacidad de suero humano calentado durante 30 min a 52°C, como fuente de C4, para convertir EAC1 en EAC14 22, 23 en presencia de BNC. Con este propósito se prepararon EAC1 incubando EA (5x108 células/ml en DVBS-Ca2+) con R4 (como fuente de C1), durante 10 min a 37°C. La formación de EAC14 a partir de EAC1, se obtuvo tratando estos intermediarios durante 10 min a 37°C con suero calentado 30 min a 52 °C, en ausencia (control del 100% de hemólisis) y presencia de BNC (3,3 mg/dl). Posteriormente las células fueron lavadas con VBS-Ca2+-Mg2+ para remover el pigmento e incubadas con R4 durante 60 minutos a 37°C. La hemólisis se determinó como se describió previamente.

El efecto de BNC sobre C2 se evaluó por la habilidad de suero humano depletado de C4 (reactivo R4) para transformar EAC14 en EAC142 [22,23] en presencia de BNC. Con este propósito se obtuvieron EAC142 por tratamiento de EA (5x108 células/ml en DVBS-Ca2+) con suero fresco durante 60 min a 0°C. Los EAC142 se incubaron luego a 37°C durante 90 min para remover C2 obteniendo así EAC14. Estas células se resuspendieron en DVBS-Ca2+-Mg2+ y se incubaron con reactivo R4 (como fuente de C2) durante 60 min a 0°C, en ausencia (control del 100% de lisis) y presencia de BNC (3,3 mg/dl). Después de lavar las células para remover el pigmento, la hemólisis de los EAC142 se obtuvo tratando estos intermediarios con suero de rata diluido 1:30 en VBS-EDTA (fuente de C3-C9) durante 60 min a 37°C.

El efecto de BNC sobre C-EDTA (el cual involucra la participación de los componentes C3 a C9) se determinó por la habilidad de suero humano diluido en VBS-EDTA para hemolizar EAC142 22, 23 en presencia de BNC. Para ello se prepararon intermediarios celulares EAC142 incubando EA (5x108 células/ml en VBS- Ca2+- Mg2+) con suero humano fresco durante 4 h a 0°C. Posteriormente estas células se trataron con suero humano diluido en VBS-EDTA (fuente de C3-C9) durante 60 min a 37°C, en ausencia (control del 100% de lisis) y presencia de BNC (3,3 mg/dl). La hemólisis se evaluó como se describió anteriormente. El agregado de EDTA, asegura la inhibición de los componentes C1, C4 y C2 (por secuestro de Ca2+ y Mg2+) y la iniciación de la vía clásica a partir de C3.

3.8.2. EFECTO DE BNC SOBRE LA UNIÓN DE C1q a IgM e IgG HUMANAS

Para determinar si BNC interfería la unión de C1q a las inmunoglobulinas humanas IgM e IgG, se diseñó un enzimoinmunoanálisis no competitivo basado en la capacidad de C1q para unirse a los fragmentos Fc de las moléculas de inmunoglobulina.

Tiras de poliestireno se incubaron durante la noche a 4°C con 100 m l de una solución de IgM o IgG humanas preparadas en una concentración de 10 m g/ml en solución de Na2CO3/NaHCO3 0,05 M; pH 9,6. Posteriormente las tiras se lavaron, se bloquearon con PBS-T-BSA (60 min a T ambiente) y se incubaron con suero humano normal (fuente de C) diluído 1:5 en VBS-Ca2+-Mg2+ durante 5 min a 37°C, en ausencia y presencia de BNC (2,0; 4,0; 8,0; 12,0; 16,0 y 20,0 mg/dl). Después de lavar con VBS-EDTA 10 mM, las tiras se incubaron durante 60 min a 4°C con 100 m l de antisuero anti-C1q humano diluido 1:2.000 en PBS-T. Las tiras fueron posteriormente lavadas con PBS-T e incubadas durante 120 min a 4°C con 100 m l de antisuero anti-inmunoglobulinas de cabra conjugadas con peroxidasa, diluido 1:10.000 en PBS-T. Después de lavar con PBS-T se agregaron 100 m l de TMB y se incubó durante 30 min a T ambiente. La reacción se detuvo por el agregado de 50 m l de H2SO4 2N y se determinaron las densidades ópticas a 450 nm. Los porcentajes de inhibición se calcularon comparando los valores de absorbancia con los obtenidos en los controles sin BNC.

3.9 EXPERIMENTOS IN VIVO

Para evaluar el efecto de BNC sobre la actividad hemolítica del C in vivo, se desarrolló un modelo experimental de hemólisis intravascular mediada por C, la cual fue provocada por transfusión de E a ratas Wistar portadoras de anticuerpos heterófilos con capacidad fijadora de C (título 8-16). El aumento de hemoglobina en plasma y el hallazgo de hemoglobinuria, se consideraron indicadores de hemólisis intravascular.

3.9.1. ANIMALES Y TRATAMIENTO

Se emplearon ratas Wistar hembras adultas con anticuerpos hemolíticos naturales contra E. Todos los procedimientos fueron realizados de acuerdo con las pautas del NIH para el cuidado y utilización de animales de laboratorio. Las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico (10 mg/kg de peso corporal) y se canalizó la vena femoral con un tubo de polietileno (PE 50). Una muestra de sangre fue obtenida de la cola y se utilizó para la determinación de la actividad hemolítica del C. Los animales fueron luego inyectados (vena femoral) con 0,3; 0,6; 0,9 ó 2,0 mg de BNC por 100 g de peso corporal, disueltos en 1 ml de solución salina de NaOH (pH: 7,8-7,9). Inmediatamente se realizó una infusión de 0,02; 0,04; 0,06 ó 0,15 mg del pigmento por 100 g de peso corporal por min, respectivamente (grupos infundidos con BNC) o de solvente de BNC (grupo control), manteniéndose estas infusiones durante todo el experimento. Luego de 10 min, se administró a los mismos animales 0,5 ml de una suspensión de E en VBS-Ca2+- Mg2+ por vía endovenosa. Después de 30 min, las ratas fueron sacrificadas por punción cardíaca, recolectándose las muestras de sangre correspondientes y recogiéndose el contenido total de orina por punción vesical. Una alícuota de sangre se dejó coagular a 4°C durante 4 h. En el suero obtenido después de centrifugar se determinó la concentración de BNC y la actividad hemolítica del C. Otra alícuota de sangre fue recogida en un tubo conteniendo citrato de sodio al 3,8% y se centrifugó para obtener plasma y medir hemoglobina. La presencia de hemoglobina también fue determinada en orina. Un grupo adicional de ratas, que llamamos ratas normales, fueron inyectadas sólo con VBS-Ca2+- Mg2+ (solvente de E). Se recolectaron muestras de plasma y orina, como se describió anteriormente, para la determinación de hemoglobina.

3.9.2 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE BNC EN SUERO

Las concentraciones de BNC alcanzadas en suero se determinaron utilizando un equipo comercial (Wiener lab) cuya técnica aplica el método de Jendrassik y col.,25 basado en la reacción específica de bilirrubina con el ácido sulfanílico diazotado.

3.9.3 DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA EN PLASMA Y ORINA

La concentración de hemoglobina en plasma y orina se realizó por el método de Vanzetti y col.,26 Esta técnica se basa en la capacidad del grupo hemo de catalizar la reacción de oxidorreducción entre la bencidina y el agua oxigenada en medio acético. Para analizar la presencia de hemoglobina en orina, se realizó una electroforesis en gel de agarosa preparado al 1% en veronal sódico 75 mM, pH 8,6.27 Las bandas proteicas fueron visualizadas por tinción con Negro Amido B 0,5% P/V e identificadas con un testigo apropiado.

3.9.4. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD HEMOLÍTICA DEL C

La actividad hemolítica total del C en las muestras de suero se determinó utilizando la técnica descripta por Mayer.22 El nivel de C en suero se expresó como la cantidad de unidades CH50/ml y se calculó el porcentaje de disminución después de la transfusión de E.

3.10. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Todos los datos se presentan como el promedio ± desvío estándar (DS).

Ensayos in vitro: Los resultados obtenidos en el ensayo de actividad hemolítica global del C y en el enzimoinmunoensayo se analizaron utilizando el test de Bonferroni precedido por ANOVA. Los resultados obtenidos sobre la actividad hemolítica de los componentes individuales del C se analizaron empleando la prueba t de Student.

Ensayos in vivo: La concentración plasmática de hemoglobina, la excreción urinaria de hemoglobina y los niveles séricos de BNC se analizaron empleando el test de Bonferroni precedido por ANOVA. Los porcentajes de disminución obtenidos en la actividad hemolítica del C se analizaron empleando la prueba U de Mann-Whitney.

Se consideraron estadísticamente significativos los valores de p< 0,05.

4. RESULTADOS

4.1. EXPERIMENTOS IN VITRO

4.1.1. EFECTO DE LOS PIGMENTOS BILIARES SOBRE LA VÍA CLÁSICA DEL C

4.1.1.1. EFECTO DE LOS PIGMENTOS BILIARES SOBRE LA ACTIVIDAD HEMOLÍTICA GLOBAL DEL C

La Fig. 1 muestra el efecto de distintas concentraciones de BNC, MGB y BV sobre la actividad hemolítica global del C. Puede observarse que tanto BNC como MGB mostraron un patrón de inhibición de la hemólisis dosis-dependiente. El efecto de BNC fue mayor que el de MGB, puesto que la inhibición máxima se alcanzó con una concentración de 3,3 mg/dl de BNC, en tanto que se requirió una concentración de 7,0 mg/dl de MGB para lograr el mismo efecto. Por el contrario, no se observó efecto de BV sobre la actividad hemolítica del C.

El pretratamiento de los EA con BNC (5 mg/dl) no tuvo efecto inhibitorio sobre la hemólisis mediada por C (resultados no mostrados) sugiriendo que la acción anticomplementaria de BNC no se debió a un efecto directo del pigmento sobre la membrana del eritrocito.

Cuando se adicionó HSA al medio de reacción en concentraciones similares o inferiores a las que se encuentran en plasma normal, no se observaron cambios sustanciales en el patrón de inhibición ni en la máxima capacidad inhibitoria de BNC (resultados no mostrados).

4.1.1.2. EFECTO DE BNC SOBRE LA ACTIVIDAD HEMOLÍTICA DE LOS COMPONENTES INDIVIDUALES DEL C

Considerando que BNC mostró un mayor efecto inhibitorio que MGB sobre la actividad hemolítica global del C por la vía clásica, circunscribimos nuestro estudio a BNC para establecer sobre cuál o cuáles de los componentes de esta vía ejercía su acción inhibitoria.

Como se puede observar en la Fig. 2, C1 fue el principal componente afectado por BNC, observándose una reducción aproximada del 60% en su actividad hemolítica para 3,3 mg/dl de BNC. La misma concentración de BNC inhibió en menor grado la etapa C-EDTA que involucra la participación de los componentes C3 a C9, no mostrando efecto sobre los componentes C4 y C2.

La Fig 3 muestra el efecto de distintas concentraciones del pigmento sobre la capacidad hemolítica de C1. Puede observarse un patrón de inhibición de la hemólisis dosis-dependiente, similar al encontrado en la vía clásica global.

4.1.2. EFECTO DE BNC SOBRE LA UNIÓN DE C1q a IgM e IgG HUMANAS

C1q es el subcomponente de C1 involucrado en la iniciación de la activación del C por la vía clásica mediante la unión de sus cabezas globulares al dominio Fc de las moléculas de IgM e IgG que forman parte de complejos inmunes. Para determinar si BNC interaccionaba con C1q, se desarrolló un ensayo de ELISA y se analizó el efecto del pigmento sobre la unión de este subcomponente a IgM e IgG humanas fijadas a una fase sólida. Como se muestra en la Fig. 4, la unión de ambas inmunoglobulinas fue inhibida por BNC en una manera dosis-dependiente hasta una concentración de 12 mg/dl. A concentraciones más altas hubo una tendencia a la saturabilidad, con una inhibición máxima de aproximadamente 45% y 60% para IgM e IgG respectivamente. Los resultados obtenidos sugieren que la interacción de BNC con C1 podría producirse en las cabezas globulares de C1q o en una región próxima a éstas.

4.2. EXPERIMENTOS IN VIVO

4.2.1. CUANTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINA EN PLASMA Y ORINA

El nivel de hemoglobinemia en los animales controles (transfundidos con E) fue 1,77 ± 0,51 mg/ml (promedio ± DS, n=4), sugiriendo que la transfusión de E provocó una reacción hemolítica intravascular. Este resultado no fue afectado por la infusión de BNC (datos no mostrados). El nivel de hemoglobinemia en las ratas que recibieron el solvente de E (grupo normal) fue inferior a 0,01 mg/ml.

La Fig. 5 muestra que la excreción urinaria de hemoglobina en los animales tratados con BNC y transfundidos con E, disminuyó en forma dosis-dependiente, encontrándose una relación inversa entre la masa de hemoglobina excretada en orina y los niveles séricos de BNC.

4.2.2. UROPROTEINOGRAMA EN GEL DE AGAROSA

La Fig. 6 muestra que la orina de ratas transfundidas con E, mostró una banda proteica principal, identificada como hemoglobina, la cual disminuyó en intensidad a medida que aumentaron los niveles séricos de BNC. Esta banda no se observó en la orina de ratas normales. La electroforesis también muestra que no aparecieron bandas proteicas adicionales en orina, excepto la de albúmina, la cual también estuvo presente en la orina normal. Estos resultados indican que la hemoglobinuria resultó de la filtración glomerular de un exceso de hemoglobina libre en plasma y no de una alteración renal inespecífica.

4.2.3 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD HEMOLÍTICA DEL C

Para confirmar que el C estaba involucrado en la reacción hemolítica descripta precedentemente, se evaluó su actividad global en las muestras de suero de las ratas controles y de las ratas infundidas con BNC (4,7 mg/dl), antes y después de la transfusión de E. Como se puede observar en la Fig. 7, la actividad hemolítica del C disminuyó en ambos grupos después de la transfusión de E, indicando la participación de este sistema en la reacción hemolítica intravascular. El porcentaje de disminución en la actividad del C fue significativamente menor en las ratas infundidas con BNC [30 (23-42), mediana (rango), n=6] que en las ratas controles [51 (46-56), mediana (rango), n=6], sugiriendo que BNC previno parcialmente la activación del C y la hemólisis resultante.

5. DISCUSIÓN

La bilirrubina es un pigmento biliar derivado del catabolismo de las hemoproteínas. Si bien se ha demostrado que la bilirrubina ejerce numerosos efectos tóxicos,16 investigaciones recientes indican que puede tener un efecto beneficioso como antioxidante endógeno.17-20 Por otra parte se ha demostrado que BV inhibe las reacciones inflamatorias y alérgicas, debido a sus propiedades anticomplementarias, sugiriéndose que podría actuar como un protector tisular endógeno.6 A pesar de que BV y bilirrubina son miembros de la familia de los pigmentos biliares, ambas difieren marcadamente en sus propiedades fisicoquímicas debido a que la bilirrubina presenta dobles enlaces hidrógeno intramoleculares.13 La interacción con estructuras proteicas y lipídicas puede, por lo tanto, diferir sustancialmente entre ambos compuestos y en consecuencia el efecto reportado para BV sobre el sistema del C, no necesariamente es aplicable a bilirrubina.

En este trabajo se encontró que BNC, en concentraciones superiores al rango fisiológico y en una manera dosis-dependiente, inhibe la actividad hemolítica del C in vitro por la vía clásica (Fig. 1) y que este efecto del pigmento se ejerce principalmente sobre el componente C1 (Fig. 2). En contraste con lo reportado por Nakagami y col.,6 nuestros resultados no mostraron efecto de BV sobre la actividad hemolítica del C. Esta controversia podría atribuirse a la utilización de diferentes protocolos experimentales y/o de distintas fuentes de C. En este trabajo se usó suero humano como fuente de C en lugar de suero de cobayo. Además, los sueros se utilizaron en diluciones diferentes en ambos estudios.

El efecto de BNC sobre el componente C1 se evaluó por la capacidad del pigmento para inhibir la actividad hemolítica de este componente (Fig. 3) así como la unión de C1q a IgM e IgG humanas fijadas a un soporte sólido por ELISA (Fig. 4). Se encontró que el efecto inhibitorio de BNC fue mayor en el ensayo hemolítico que en el enzimoinmunoensayo. Aunque se desconocen las causas de esta observación, estas diferencias podrían deberse a la naturaleza química del sitio de unión del C sobre el anticuerpo. Se presume que sobre la superficie de los eritrocitos de carnero las inmunoglobulinas se disponen en forma lineal, con el fragmento Fc libre en solución. Es posible que las inmunoglobinas fijadas a una fase sólida presenten una geometría y estequeometría muy diferente, lo cual podría explicar tentativamente los diferentes patrones de inhibición observados. Estos hallazgos son coincidentes con los de Miletic y col. que indican una menor capacidad de las inmunoglobulinas para inhibir la captación de C4 por inmunocomplejos fijados a una fase sólida que sobre EA sensibilizados.28 Nuestros resultados también indicaron que BNC necesita unirse a C1q para ejercer su efecto inhibitorio. Considerando que las inmunoglobulinas se unen a las cabezas globulares de C1q,29 es posible que BNC interaccione con las cabezas globulares de C1q o en una región próxima a éstas.

Aunque el MGB también inhibió la actividad hemolítica del C por la vía clásica, el efecto fue menor que el observado para BNC (Fig. 1). Este resultado indica claramente que la glucuronidación de BNC disminuyó su efecto inhibitorio sobre la actividad hemolítica global del C por la vía clásica. Se conoce que ambos compuestos presentan un diferente número de uniones hidrógeno intramoleculares que determinan diferencias en su estructura y en sus propiedades fisicoquímicas.11, 13 Estas diferencias podrían conducir a interacciones variables con los componentes del C. Si bien en la bilis de los individuos sanos y en la de los pacientes con síndrome de Gilbert predominan los DGB, en la hemólisis y en la colelitiasis,30 la mayoría de los pigmentos séricos están constituidos por los isómeros monoconjugados C-8 y C-12, particularmente MGB C-8 y C-12.14, 15 En consecuencia, nuestros hallazgos sugieren que el MGB podría tener un efecto modulador de las reacciones del C in vivo.

Es conocido que el C participa en la fisiopatología de la hemólisis inmune intravascular. Generalmente, los anticuerpos que desencadenan la lisis intravascular son aquellos que presentan actividad lítica in vitro. La destrucción eritrocitaria intravascular ocasiona el incremento de los niveles plasmáticos de hemoglobina. Si la producción de hemoglobina excede la capacidad de transporte de haptoglobina, se puede encontrar hemoglobina libre en plasma y en orina. Por consiguiente, la excreción urinaria de hemoglobina puede considerarse indicadora de hemólisis intravascular.4

En este trabajo se evaluó la capacidad de BNC para prevenir una reacción hemolítica aguda inducida por la transfusión de E a ratas Wistar portadoras de anticuerpos heterófilos con capacidad fijadora de C. Los resultados obtenidos en la electroforesis de las muestras de orina de las ratas infundidas con BNC y transfundidas con E, sugieren que BNC ejerció un efecto protector sobre la hemólisis intravascular C-dependiente. El uroproteinograma también muestra que no aparecieron bandas adicionales a la de hemoglobina, excepto la de albúmina, la cual también estuvo presente en la orina de ratas controles (Fig. 6). Este hallazgo sugiere que la hemoglobinuria resultó de la filtración glomerular de la hemoglobina libre en plasma y no de un pasaje indiscriminado de glóbulos rojos a través de las estructuras glomerulares, debido a una alteración de sus propiedades de barrera.

Asimismo la excreción urinaria de hemoglobina disminuyó en forma dosis-dependiente (Fig. 5). Sin embargo, aunque se observó un aumento de la hemoglobinemia luego de la transfusión de E, no se encontraron diferencias significativas en los niveles plasmáticos de hemoglobina entre los controles y los animales hiperbilirrubinémicos. Considerando que las muestras de sangre se tomaron 30 min después de la transfusión de E, es probable que la producción máxima de hemoglobina haya ocurrido antes de ese tiempo y/o que la depuración renal de hemoglobina libre sea un proceso muy eficiente.

La actividad hemolítica del C disminuyó en las ratas controles y en los animales infundidos con BNC después de la transfusión de E, indicando la participación del C en la reacción hemolítica intravascular (Fig. 7). Sin embargo, el porcentaje de disminución en la actividad hemolítica del C fue significativamente menor en los animales hiperbilirrubinémicos que en los controles, sugiriendo que BNC fue capaz de prevenir parcialmente la activación del C y la hemólisis resultante.

Considerando los hallazgos de los estudios in vitro es posible concluir que el efecto inhibitorio del pigmento sobre las reacciones hemolíticas mediadas por C in vivo, se inicie a través de su interacción con C1q.

Nuestros resultados no excluyen que BNC pueda interaccionar con los otros subcomponentes de C1, es decir, C1r y C1s. Esta posibilidad merece ser explorada en el futuro.

Las propiedades anticomplementarias de la bilirrubina podrían atenuar las enfermedades en las cuales está involucrada la injuria celular mediada por C, tales como las anemias hemolíticas autoinmunes,12 la hepatitis B aguda 31, 32 o el rechazo hiperagudo de un trasplante hepático ABO incompatible.33 En contrapartida, considerando la participación del C en la defensa contra bacterias y virus, la hiperbilirrubinemia podría contribuir a incrementar la susceptibilidad a infecciones, especialmente en situaciones de deficiencia de C como ocurre en las enfermedades hepáticas crónicas o en el recién nacido. 34, 35 Al presente, no se ha realizado ningún estudio poblacional en pacientes que permita evaluar estas posibilidades.

Agradecimientos: Este trabajo fue realizado con subsidios de la Universidad Nacional de Rosario, Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica y Fundación Antorchas.

(Recibido: mayo de 2003; Aceptado: junio de 2003)

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IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DERIVADAS DE LA a₂ MACROGLOBULINA EN EL HUESO DE RATAS TRATADAS CON MONOFLUOROFOSFATO DE SODIO. ROL DE ESTAS PROTEÍNAS EN LA BIODISPONIBILIDAD DE FLÚOR ^#

Laura I. Pera, Lucas R.M. Brun, Alfredo Rigalli*, Rodolfo C. Puche.

Laboratorio de Biología Ósea, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Rosario.

Resumen

El fluoruro de sodio (NaF) y el monofluorofosfato de sodio (MFP) son utilizados en el tratamiento de la osteoporosis, presentando entre sí diferencias metabólicas y farmacocinéticas. Al administrar NaF, en plasma predomina el anión fluoruro. Luego de una dosis de MFP, en el plasma se encuentra fluoruro y flúor ligado a la a 2-Macroglobulina (a 2M). Ambos tratamientos aumentan la masa ósea, pero el contenido de flúor en el hueso de los animales tratados con NaF es menor que en los tratados con MFP. En hueso de ratas tratadas con MFP existen proteínas con F, que están ausentes en tratamiento con NaF. Los objetivos de este trabajo fueron comprobar si las proteínas óseas con flúor provienen del complejo entre la a 2M y el MFP e investigar el rol que tienen estas proteínas en la biodisponibilidad de F del MFP. Se purificó a 2M a partir de plasma de ratas adultas IIM/FcM, línea "m". La a 2M se utilizó para obtener anticuerpos antia 2M por inoculación en cobayos. Se utilizaron ratas hembras de 21días, de la misma línea. Ocho ratas recibieron 1 ml/día de MFP 80 mM y ocho ratas recibieron 1 ml/día de NaF 80 mM. A los 30 días se suspendió el tratamiento; 4 ratas de cada grupo fueron sacrificadas. Los animales restantes se mantuvieron durante 30 días sin tratamiento. Al final de este período se sacrificaron los 8 animales restantes. A los 30 y 60 días se obtuvieron muestras de plasma y los fémures. En los plasmas se determinó la concentración de flúor. Se extrajeron las proteínas no colágenas de los fémures y se identificaron las proteínas por Western blot utilizando el anticuerpo antia 2M. A los 30 días, las ratas con MFP poseen en el hueso especies reactivas con el anticuerpo antia 2M. A los 60 días se produce un aumento de las proteínas de menor peso molecular y disminución de las de mayor peso molecular. Treinta días después de suspender el tratamiento con NaF, la fluoremia aumentó significativamente. Este cambio no se observó en los tratamientos con MFP.

Se concluye que las proteínas con flúor ligado, presentes en hueso de ratas tratadas con MFP, provienen de la a 2M. La degradación de estas proteínas daría compuestos de menor peso molecular y produciría concentraciones efectivas de fluoruro en el ambiente osteoblástico, estimulando de esta manera la formación ósea. Esta recirculación ósea explicaría la constancia de la fluoremia a lo largo del tratamiento con MFP.

Palabras clave: monofluorofosfato; fluoruro; matriz ósea; macroglobulina.

IDENTIFICATION OF BONE a₂ MACROGLOBULIN (a 2M)-RELATED PROTEINS IN RATS TREATED WITH MFP. THEIR ROLE IN FLUORINE (F) BIOAVAILABILITY.

Summary

Sodium fluoride (NaF) and sodium monofluorophosphate (MFP) are both used in osteoporosis treatment, and produce the same increase in bone mass. However, they have sig-nificant differences. When NaF is administered, fluoride is the plasmatic lead-ing specie. After a dose of MFP, fluoride and F bound to a 2M are detected, bone F content is higher, and unknown bone proteins with F have been found. The objectives of this work were to verify whether proteins with F are products of the a 2M-MFP complex metabolism, and to investigate their role in F bioavailability from MFP. Plasmatic a 2M was purified from IIM/FcM rats, then it was used to produce antibodies in Guinea pig. Twenty-day-old rats of the same strain recibed 1 ml/day of MFP 80 mM (n= 8) or NaF 80 mM (n= 8). After 30 days, treatments were stopped. Four rats of each group were killed, the others were kept without treatment for 30 days. Femurs and plasma were obtained from each animal at 30 and 60 days. Plasma F levels were measured, noncollagenous bone proteins were obtained and analyzed by Western blotting. Bone from 30-day MFP-treated rats contained proteins reactive to anti-a 2M. After stopping treatment, low molecular weight proteins increased and those of high molecular weight decreased. Plasma F increased in animals treated with NaF after stop-ping treatment; this phenomenon was not observed in MFP treatment. In conclusion, F containing proteins come from a 2M and their metabolism produces lower molecular weight compounds. The event would cause effective fluoride levels in the osteoblastic environment and could explain the steady plasmatic F levels throughout MFP treatment.

Keywords: monofluorophosphate; fluoride; bone matrix; macroglobulin.

1. INTRODUCCIÓN

Las sales que contienen flúor han sido utilizadas ampliamente para el tratamiento de la osteoporosis. Las más utilizadas son el fluoruro de sodio (NaF) y el monofluorofosfato de sodio (MFP). 1, 2 Ambas sales son administradas por vía oral y se absorben a nivel gástrico e intestinal presentando entre sí diferencias importantes.3 Luego de administrar NaF la especie química predominante en plasma es fluoruro iónico (F-), mientras que luego de administrar MFP se encuentra F- y flúor ligado a proteínas.4-6 Tanto en ratas como en seres humanos hemos demostrado que el MFP se une a la a 2-macroglobulina plasmática (a 2M). Esta fijación produce una disminución transitoria de la actividad de la a 2M, in vivo e in vitro.7 Este último fenómeno ha sido demostrado con plasma fresco y con la proteína purificada. El MFP ligado a la a 2M es captado por células óseas, donde el complejo es metabolizado liberándose al plasma fluoruro y flúor ligado a péptidos de menor peso molecular.8

El tratamiento con NaF y MFP aumenta la masa ósea, alcanzándose masas óseas similares con ambas sales. Sin embargo, el contenido de flúor óseo encontrado en animales tratados con NaF es menor que en los animales tratados con MFP, aún cuando las dosis de flúor son equivalentes.4 Estos resultados indican que utilizando MFP se alcanzarían similares resultados que con el NaF pero con la mitad de la dosis, debido a que el MFP tiene el doble de biodisponibilidad de flúor.4, 5

Trabajos previos realizados en este laboratorio demostraron que en hueso de ratas tratadas con MFP existen proteínas con flúor ligado por enlace resistente al tratamiento con ácidos. Estas proteínas de pesos moleculares comprendidos entre 15 y 60 kDa no se hallan presentes en hueso de ratas controles o tratadas con NaF. En ese trabajo se comprobó que estas proteínas se metabolizan a péptidos de menor peso molecular y a fluoruro.

Los experimentos que se detallan a continuación estuvieron destinados a comprobar si esas proteínas con F ligado son derivadas del complejo a 2M-MFP y comprobar la influencia de estas proteínas en la mayor biodisponibilidad de F cuando se utiliza MFP con respecto a NaF. Para la realización de estos experimentos se debió purificar a 2M de rata ya que no se encuentra disponible en el mercado, y producir anticuerpos antia 2M de rata por inoculación de la proteína purifica en cobayos. Estos anticuerpos fueron posteriormente utilizados para la inmunodetección de la a 2M o proteínas relacionadas.

1. MATERIALES Y MÉTODOS

   En los experimentos donde se investigó la composición y el metabolismo de los compuestos óseos con flúor se utilizaron ratas hembras IIM/FcM, línea "m" 9 de 21 días de edad, provistas por el Bioterio Central de la Facultad de Ciencias Médicas.

   Para la obtención de anticuerpos antia 2-macroglobulina de rata se utilizaron cobayos hembras adultas, suministradas por el Bioterio Central de la Facultad de Ciencias Médicas.

   Para la purificación de a 2M se partió de plasma obtenido a partir de sangre extraída de ratas "m" hembras adultas de 200-300 g, por punción cardíaca.

   1. Tratamientos

      El diseño experimental incluyó tres grupos de ratas. Grupo A: tratadas con 1 ml de agua (n= 8). Grupo B: tratadas con 1 ml/día de solución de MFP 80 mM (n= 8). Grupo C: tratadas con 1 ml/día de solución de NaF 80 mM (n= 8). Los animales recibieron las soluciones por la mañana, utilizando un catéter de polietileno PC50 que se introdujo por la boca hasta llegar al estómago. El grupo A se utilizó como control de la efectividad de los tratamientos B y C.

      Las soluciones de MFP fueron preparadas semanalmente, para evitar la disminución de su título, producto de la hidrólisis espontánea en solución acuosa;10 en todos los casos se partió de MFP (Ozark Mohoning; Tulsa, OA, USA) con menos de 5% de hidrólisis.

      A los 30 días se suspendió el tratamiento y 4 ratas de cada grupo se sacrificaron por punción cardíaca bajo anestesia con éter. Se separaron los plasmas y se extrajeron los fémures. Los animales restantes se mantuvieron en jaulas metabólicas individuales sin recibir NaF o MFP, con agua y comida ad libitum durante los siguientes 30 días. Al finalizar este período se sacrificaron los 12 animales, obteniendo los plasmas y los fémures. En los plasmas se determinó la concentración de flúor como se detalla en 3.7. Las proteínas no colágenas de los fémures se obtuvieron como se detalla en 3.4. Con las soluciones de EDTA se realizó electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)11 y Western blot. Ambas técnicas se realizaron con protocolos estándar.

   2. Purificación de a 2M de rata

      La a 2M es una proteína cuya concentración es constante en el ser humano, pero en la rata es una proteína de fase aguda.12 En el mercado no se encuentran disponibles anticuerpos antia 2M de rata, por lo que para detectar la presencia de la a 2M o proteínas relacionas a la a 2M en la matriz ósea fue necesario preparar dichos anticuerpos. Para la preparación de los mismos se debió purificar la proteína del plasma de ratas, a las que previamente se las estimuló con adjuvante completo de Freund (CFA), para aumentar la expresión sérica de la proteína.13 Se inyectaron alícuotas de 0,35 ml de CFA (Difco Laboratories; Detroit, Michigan, USA) a ratas "m" hembras adultas, por vía intraperitoneal . Se extrajo sangre de la vena de la cola antes de la inoculación y a las 3, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 24, 35, 48 y 59 horas de la administración de CFA. El objetivo de este muestreo fue identificar el tiempo necesario para obtener una concentración adecuada de la proteína a 2M , para iniciar su purificación.

      Con los plasmas obtenidos se realizó PAGE al 7%. Simultáneamente se procesaron patrones de peso molecular (Nondenatured protein molecular weight marker kit. Sigma; Saint Louis, Missouri, USA) para realizar una primera aproximación del peso molecular de las proteínas desconocidas. Las proteínas utilizadas como patrones fueron: albúmica sérica bovina (BSA, 66 kDa) y su dímero (132 kDa), albúmina de pollo (45 kDa), trímero de ureasa (272 kDa), hexámero de ureasa (544 kDa). En el gel se detectaron las proteínas cuya expresión aumentó luego de la inoculación con CFA y en base a este análisis se determinó el momento más apto para obtener sangre con mayor concentración de a 2M. La a 2M fue caracterizada a través de su peso molecular como se detalla en 3.2.1.

   3. Caracterización de la a 2M en geles de poliacrilamida

      Con el objetivo de calcular con mayor exactitud el peso molecular de las proteínas plasmáticas que aumentaron su concentración luego del estímulo con CFA, se realizaron PAGE al 6, 7, 8 ,9 y 10 % en condiciones no desnaturalizantes. Las muestras y los patrones de peso molecular se procesaron simultáneamente. Se calcularon las relaciones de frente (Rf) para la proteína de peso molecular desconocido y para cada uno de los patrones de peso molecular, en los geles de diferentes porcentajes de acrilamida. Se realizó la regresión lineal entre una transformación de los valores de la relación de frente (100.log(Rf.100)) y el porcentaje de acrilamida (ver figura 3) para los patrones de peso molecular y la proteína incógnita. Se obtuvieron las pendientes (S: coeficiente de retraso) de las rectas de regresión mencionadas. Se realizó la regresión lineal entre los logaritmos de S y los logaritmos de los pesos moleculares de los patrones y sus respectivos pesos moleculares (ver figura 4). Utilizando la recta de regresión mencionada en último térmico se estimó el peso molecular de la proteína incógnita.

   4. Purificación de a 2-macroglobulina

      Previo a realizar la extracción del plasma de rata para la purificación de a 2M, los animales fueron inoculados con CFA como se detalló en 3.2, con el objetivo de aumentar la expresión de la proteína. A las 48 hs del estímulo se extrajo sangre por punción cardíaca con heparina como anticoagulante. El tiempo para la extracción fue elegido en base al análisis del gel obtenido en la electroforesis (figura 1)

      Para el aislamiento de la proteína se utilizó la técnica descripta por Swenson y Howard.14 Sintéticamente la misma involucra precipitación selectiva con polietilenglicol, fraccionamiento con sulfato de amonio, diálisis y cromatografía sobre DEAE celulosa.15

   5. Prueba de actividad antitripsina de la a 2M

      La a 2M posee la capacidad de unirse a la tripsina activa. Esta propiedad fue utilizada para comprobar si la proteína purificada era a 2M. La migración de la tripsina en electroforesis en gel de poliacrilamida y su actividad se ven afectadas si previamente se incuba con cantidades equimoleculares de a 2M. Se realizó PAGE al 7 %. En la calle N° 1 se sembraron sólo 40 μg de tripsina purificada, para identificar la banda correspondiente a esta proteasa. En la calle N° 2 se sembraron 40 μg de albϊmina sérica bovina preincubada con 40 μg de tripsina, con el objetivo de verificar que la tripsina se encuentre activa. En la calle N° 3 se sembraron 40 μg de albϊmina sérica bovina como control de la calle N° 2. En la calle 4 se sembró la solución conteniendo 316 μg de a 2M purificada (1,7x10-3 μmol) obtenida en el paso correspondiente a la cromatografνa en DEAE celulosa (3.2.2) preincubada con 40 μg de tripsina. En la calle N° 5 se sembraron316 μg de proteína sin capacidad de fijación de tripsina preincubada con 40 μg de tripsina, como control de la calle N° 4. La elecciσn de la cantidad de tripsina utilizada en el ensayo (40 μg de tripsina = 1.7x10-3 μmol) se realizσ teniendo en cuenta la cantidad de proteína presente en la última etapa de la purificación (calle 4). Se realizó la tinción de las proteínas del gel con Coomasie Brilliant Blue. La desaparición de la banda de tripsina en la calle donde se incubó previamente con la solución purificada, indica la presencia de a 2M.

   1. Producción de anticuerpo anti-a 2-macroglobulina

      La solución conteniendo la proteína a 2M purificada se utilizó para la inoculación de los cobayos como se detalla a continuación. Se inyectaron en forma subcutánea e intramuscular 100 μl de solución (0,06 mg de a 2M) emulsionada con 0,5 ml de CFA o adjuvante incompleto de Freund (IFA) dependiendo de la fase de la estimulación. Las extracciones de sangre se realizaron por punción cardíaca sin utilizar anticoagulante, manteniendo al animal anestesiado con éter. Se separó el suero de las muestras de sangre y se guardó a -20°C. Se trabajó con el siguiente protocolo de inoculación: se extrajo una muestra antes de realizar la primer inoculación (muestra M1). El mismo día se inyectaron 100 μl de la solución con CFA. A los 15 días, se extrajo una muestra de sangre (muestra M2). Luego de 30 días se realizó una nueva inoculación de 100 μl de a 2M purificada emulsionada con un 1 ml de IFA. A los 20 días se extrajo una muestra de sangre (muestra M3). Se repitieron 2 reinoculaciones en las condiciones descriptas obteniéndose otras dos muestras de sangre (M4 y M5). La presencia de anticuerpos anti-a 2M en las muestras de sangre se realizó por inmunodifusión en agar utilizando la técnica de Outcherlony.16 La muestra M5 en la que se detectó un alto título de anticuerpos anti-a 2M se utilizó como anticuerpo primario para la inmunodetección de proteínas luego de la electroforesis y transferencia a membrana de nitrocelulosa. Esta muestra de suero fue utilizada en una dilución 1/100, dilución que resultó óptima para el Western blot.

   2. Obtención de proteínas óseas no colágenas

      Se utilizó el método descripto por Glimcher y Katz.17 Se extrajeron los fémures de las ratas, se eliminaron los restos de tejido muscular y ligamentos. Luego de un corte en la parte media de la diáfisis se eliminó la médula ósea. Se trozó cada hueso en cortes de 0,5 mm y se colocó en un tubo con 3 ml de EDTA 0,5 M pH= 8,3 con agitación constante a 4° C. El progreso de la extracción del mineral se controló utilizando la determinación de fluoruro por potenciometría directa (3.6) del extracto con EDTA. Cuando la concentración de flúor comenzó a ser constante, los cortes de hueso se transfirieron a otros 3 ml de EDTA. Se realizaron 4 extracciones. La extracción de flúor del hueso es paralela a la extracción del mineral, ya que el flúor se encuentra formando parte de los cristales de fluoroapatita. La concentración de flúor en los extractos con EDTA, [mineral](t), se ajusta por la siguiente función exponencial del tiempo: [mineral](t) = [mineral]MAX (1-e-k*t). Donde [mineral]MAX es la concentración máxima de flúor en el extracto y k la constante de extracción.Aplicando esta expresión se deduce que el tiempo de vida media de la extracción es de 34,42±1.9 horas (media±ES). En base a este dato se puede afirmar en la tercer extracción (220 hs) se ha eliminado del hueso más del 99 % del mineral. Para asegurar la completa extracción se realizó una extracción hasta las 500 hs y el mineral obtenido se juntó con las demás fracciones.

   3. Dosaje de proteínas

      La concentración de proteínas se realizó utilizando el método de Bradford 18 con un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 11 (Perkin Elmer Corp.; Norwalk, Connecticut, USA).

   4. Medición de fluoruro por potenciometría directa

      La potenciometría directa permite medir la concentración del anión fluoruro en solución acuosa. En esta técnica se utilizó un electrodo de ion específico Orion 94-09 (Orion Research; Cambridge, Massachusetts, USA.) Simultáneamente se procesan soluciones testigos de NaF con concentraciones adecuadas a las muestras a medir. La fuerza iónica y el pH de las muestras y los testigos se iguala por el agregado de buffer de citrato de sodio 2 M pH= 5,5; la concentración final del buffer en la muestra es 10% V/V. Las determinaciones se realizaron a temperatura ambiente y los electrodos se ensamblaron de manera que permitieran la medición de muestras de 20 a 100 μl.19

   5. Determinación de flúor plasmático

      La determinación del flúor plasmático se realizó aislando el flúor de la muestra mediante microdestilación isotérmica 20 y posterior potenciometría directa.21

   6. Técnicas estadísticas

      Se utilizó el análisis de la variancia a un criterio de clasificación (ANOVA) en los experimentos descriptos en 4.7.22, 23 Para realizar el ajuste no lineal de datos realizado en 3.4, se utilizó un software que realiza una aproximación de la función a los puntos experimentales, haciendo mínima la suma de cuadrados de las diferencias entre los valores experimentales y el valor hallado con la función para cada valor de la variable independiente (GraphPad Prism 2.0. GraphPad Software, Inc.; San Diego, California, USA, 1994).

2. RESULTADOS
   
   1. Estimulación de la producción de a 2M con adjuvante completo de Freund

      La figura 1 muestra la electroforesis de los plasmas luego de la estimulación con CFA. La estimulación produjo un aumento de la concentración de dos proteínas (P1 y P2). Una primera aproximación de los pesos moleculares de ambas proteínas permitió descartar la proteína P2 debido a su bajo peso molecular (aproximadamente 60 kDa). La proteína P1 se sometió al estudio de su peso molecular en condiciones no desnaturalizantes como se detalla en 4.2.

   2. Caracterización de la proteína P1 en geles de poliacrilamida

      En la figura 2 se muestra la PAGE para los patrones de peso molecular y las proteínas del plasma obtenidas luego de la estimulación con CFA. Con una flecha se marca la proteína P1, que por su ubicación en el gel respecto de los patrones de peso molecular, se supone que corresponde a a 2M.Las regresión entre 100.log(100Rf) de cada patrón de peso molecular y la proteína incógnita y el porcentaje de poliacrilamida se muestra en la Ilustración 3. Las pendientes de estas regresiones se correlacionaron con el logaritmo del peso molecular de los patrones de peso molecular (ver figura 4). El peso molecular de la proteína P1 se calculó por interpolación con la recta obtenida en la figura 4. El peso molecular obtenido para la proteína fue 746 kDa. El peso molecular obtenido para la proteína P2 fue de aproximadamente 60 kDa, razón por la cual esta proteína no fue purificada.

   3. Purificación de la a 2M

      La figura 5 muestra la PAGE de las diferentes etapas de purificación de la a 2M a partir del plasma de rata. La última calle muestra la electroforesis de las proteínas halladas en la etapa de purificación sobre DEAE celulosa. Para comprobar si la proteína purificada era a 2M se investigó la capacidad de unir tripsina de la proteína purificada (ver 4.4)

   4. Prueba de la actividad antitripsina de la a 2macroglobulina

      En la figura 6 se muestra la electroforesis destinada a confirmar que la proteína purificada es a 2M. Esta proteína se caracteriza por la capacidad de unir tripsina, inhibiendo su actividad catalítica y alterando su movilidad electroforética. La flecha muestra la posición donde migra la tripsina. En la calle número 1 se observa una banda única de tripsina. En la calle 3 se observa una banda única de albúmina. En la calle 2 existen bandas de menor peso molecular que la albúmina como consecuencia de la acción hidrolítica de la tripsina. Esto comprueba que en las condiciones del experimento la tripsina permance activa. En la calle 4 se puede observar la desaparición de la banda de tripsina, lo que comprueba que la proteína purificada es a 2M. En la calle 5 que no contiene a 2M, la banda de tripsina permanece inalterada.

   5. Obtención del anticuerpo anti-a 2M

      La figura 7 muestra la inmunodifusión en agar de los sueros de cobayos inmunizados con la a 2M purificada. Si bien desde el primer ensayo se obtuvo una banda de precipitación la muestra que se utilizó como fuente de anticuerpo antia 2M fue la muestra M5. Esta muestra se diluyó 1/100 y se utilizó en las inmunodetecciones en geles de poliacrilamida.

   6. Inmunodetección en geles de poliacrilamida

      La figura 8 muestra el Western blot de proteínas de la matriz ósea de ratas controles y tratadas con NaF y MFP al final de 30 días de tratamiento (30 días) y luego de 30 días sin recibir tratamiento (60 días). A los 30 días las ratas con MFP poseen especies reactivas con el anticuerpo antia 2M de rata en mayor proporción que las controles y tratadas con NaF (ver flechas). A los 60 días existe un cambio en el patrón de bandas en las ratas tratadas con MFP. Se observa aumento de las proteínas de menor peso molecular y disminusión de las proteínas de mayor peso molecular. La presencia de especies reactivas con el anticuerpo anti a 2M en controles y tratadas con NaF y la dispersión de las bandas proteicas será analizada en la discusión de este trabajo.

   7. Flúor plasmático

      Las fluoremias de las ratas a los 30 y 60 días del experimento se muestra en la figura 9. Las fluoremias de los animales tratados con NaF y MFP no difirieron de los controles al cabo de 30 días. A los 30 días de suspender los tratamientos con NaF o MFP, la fluoremia de los animales tratados con NaF aumentó significativamente con respecto a los animales tratados con MFP y los controles. La fluoremia de los animales tratados con MFP a los 60 días no difirió significativamente del valor a los 30 días.

3. DISCUSIÓN

El tratamiento con cantidades equimolares de NaF o MFP produce un incremento similar de la masa ósea. Sin embargo, el contenido de flúor en los huesos es mayor cuando se administra MFP. En los tratamientos con esta droga, se alcanza la misma masa ósea que con NaF pero con la mitad de dosis.4 Esta mayor biodisponibilidad de flúor proveniente del MFP se atribuye a la absorción del MFP sin hidrolizar que se produce a nivel de estómago.3 Esta fracción de MFP se une a la a 2M al alcanzar la circulación.7 Como consecuencia, en plasma, luego de una dosis de MFP, se encuentran anión fluoruro y MFP unido a las proteínas. El área bajo la curva de fluoruro plasmático es el doble de la obtenida con dosis equivalentes de NaF.4 Esta mayor biodisponibilidad de flúor a partir del MFP fue comprobada en pacientes que reciben MFP como tratamiento de la osteoporosis.5 El flúor unido a la a 2M no se halla presente en los tratamientos con NaF, en los cuales la fluoremia corresponde en un 100 % a flúor iónico. La a 2M al unirse al MFP pierde su capacidad de inactivar proteasas y sufre cambios conformacionales que determinan su captación por células que poseen receptores específicos. La a 2M inactivada puede ser captada por dos tipos de receptores. La a 2M unida a MFP es principalmente depurada de la circulación por receptores scavenger.8 Se ha demostrado que estos receptores se encuentran en hígado y en hueso de ratas a través de experimentos in vitro.8 En este último trabajo se demostró que la captación del complejo a 2M-MFP es dependiente de energía, que participan microtúbulos y requiere la acción de lisosomas. Una vez que el complejo es captado, las células degradan a la proteína produciendo péptidos de menor peso molecular que contienen flúor. La presencia de estos péptidos fue demostrada tanto en ratas como en seres humanos.6 Sin embargo, en estos trabajos no se caracterizaron los péptidos mencinados. En experimentos posteriores se demostró que en el hueso de ratas tratadas con MFP existe flúor unido a proteínas. Estas proteínas tampoco fueron caracterizadas. El presente trabajo demuestra que las proteínas óseas con flúor encontradas en hueso de ratas tratadas con MFP, provienen de la a 2M. Esta comprobación se realizó utilizando anticuerpos antia 2-macroglobulina de rata. En animales controles o en aquellos tratados con fluoruro de sodio, se observan también proteínas reactivas con el anticuerpo antia 2-macroglobulina. Esta última observación se puede justificar por la constante inactivación que sufre la proteína por la interacción con proteasas como la tripsina y con sustancias nucleofílicas que pueden hidrolizar el enlace tioléster de su estructura.24 A través de las pruebas de inmunodetección en geles de poliacrilamida (Western blotting) se puedo demostrar que en las ratas tratadas con MFP durante 30 días existe mayor cantidad de estas proteínas, dado que en presencia de MFP está aumentada su inactivación y captación por las células óseas. A los 30 días de haber finalizado el tratamiento, disminuyen las proteínas de mayor peso molecular a expensas de un aumento de las proteínas de menor peso molecular. Esta observación es coincidente con la transformación de proteínas óseas con flúor en péptidos de menor peso molecular con flúor. Esta transformación como se dijo anterioremente fue demostrada en trabajos in vitro e in vivo.6La fluoremia de los animales tratados con NaF o MFP, al cabo de 30 días no discrepa de los controles. Estos resultados coinciden con los obtenidos en otros experimentos en los que se observaron valores normales de flúor plasmático durante el tratamiento con NaF.4 Cuando el flúor estímula la formación ósea, este tejido aumenta la captación del anión fluoruro, lo que conduce a que los niveles de flúor plasmático retornen a valores normales. Luego de finalizar el tratamiento, se observa un incremento en la fluoremia de los animales tratados con NaF, que no se observa en los tratados con MFP. Los resultados obtenidos en este trabajo permiten proponer un modelo de acción del MFP sobre las células ósea. En los animales tratados con MFP, la deposición de flúor como especies proteicas y su posterior metabolización a péptidos de menor peso molecular y fluoruro, generaría mayores concentraciones óseas del anión fluoruro, prolongando su efecto mitogénico sobre los osteoblastos y demorando su depuración ósea. Esta recirculación ósea del fluoruro, justificaría los niveles más bajos de fluoremia alcanzados al suspender el tratamiento en ratas tratadas con MFP, comparadas con ratas tratadas con NaF .

(Recibido: abril 2003. Aceptado: junio 2003).

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LEYENDAS DE LAS FIGURAS

Figura 1: Electroforesis en gel de poliacrilamida al 7% del suero de ratas que recibieron una inyección intraperitoneal de adjuvante completo de Freund. Las flechas marcan las proteínas P1 y P2 que aumentaron la expresión luego de la inyección. Los números indican las horas transcurridas desde la administración de CFA i.p. La calle de más a la derecha contiene los patrones de peso molecular: T1: albúmina de huevo de pollo, T2: albúmica sérica bovina, T3: Dímero de albúmina sérica bovina, T4: trímero de ureasa y T5: hexámero de ureasa.

Figura 2: Electroforesis en gel de poliacrilamida de diferentes porcentajes de acrilamida de plasma de ratas estimuladas con CFA 48 horas antes. Con una flecha se marca la a 2M. Para cada % la calle de la izquierda corresponde al plasma y la calle de la derecha a los patrones de peso molecular.

Figura 3: 100.log(100.Rf) en función del porcentaje de poliacrilamida de la electroforesis. Las pendientes de las rectas (coeficiente de retraso) se utilizaron luego para el cálculo del peso molecular de las proteínas P1 y P2.

Figura 4: representación del logaritmo del coeficiente de retraso en función del logaritmo del peso molecular de los patrones de peso molecular (g ). Las interpolaciones con la recta representan a las proteínas P1 y P2.

Figura 5: PAGE de las diferentes etapas de purificación de la a 2M a partir de plasma de ratas. De izquierda a derecha se muestran: plasma sobrenadante luego de precipitación con polietilenglicol (PEG) al 4%, sobrenadante luego de la precipitación con PEG al 12 %, precipitado con PEG al 12 %, sobrenadante del tratamiento con (NH4)2SO4 1,92 M y eluidos de la columna de DEAE celulosa.

Figura 6: PAGE de muestras de a 2M en presencia de tripsina. De izquierda a derecha las calles contienen: tripsina, tripsina + albúmina, albúmina, a 2M + tripsina, proteína sin capacidad de ligar tripsina + tripsina.

Figura 7: inmunodifusión en agar. M1 a M5 representan las muestras obtenidas luego de la estimulación con CFA en cobayos. En el pocillo del centro se sembró la a 2M purificada.

Figura 8: Western blot de las proteínas no colágenas del hueso de ratas controles, tratadas con NaF y con MFP. Con flechas se marcan las bandas de proteínas identificadas con el anticuerpo antia 2M. Las tres calles de la izquierda corresponde a las proteínas luego de 30 días de tratamiento y las tres de la derecha a las proteínas del hueso luego de 30 días de haber suspendido el tratamiento.Figura 9: fluoremia de animales tratados con MFP o NaF y controles. Las barras de la izquierda de cada grupo corresponde al valor al finalizar los 30 días de tratamiento y las de la derecha luego de 30 días sin tratamiento (* p<0,05)

ALTERACIONES EN EL HABLA Y EN LA AUDICIÓN DE JÓVENES UNIVERSITARIOS

Laura Fissore, Adriana Jannelli, Lía Bloj, Viviana Casaprima, Ana Dulout, Natalia Marcozzi, Silvana Perfumo, Elena Soler, Marilina Chinellato, Lorena Ingaramo y Gloria Drogo.

Escuela de Fonoaudiología, Facultad de Ciencias Médicas, UNR.

Resumen

Los objetivos fueron detectar alteraciones auditivas, dificultades en la expresión verbal y en los aspectos fonológicos del lenguaje; indagar acerca del conocimiento de los efectos nocivos del ruido; establecer la presencia de hábitos auditivos y síntomas vinculados a la exposición a música amplificada. La muestra estuvo constituida por 120 jóvenes que cursan la asignatura Física Biológica de la carrera de Medicina de la UNR. Se aplicó una encuesta y un protocolo para evaluar el área Habla. En el área Audición se trabajó con un cuestionario y posteriormente se realizó una audiometría tonal. Los resultados principales en el área Habla muestran que el 75% presentó alguna alteración; de este valor, un 74% en la prosodia y un 56% en la oclusión. Un 37% de los jóvenes refirió en la encuesta problemas en la pronunciación de sílabas y/o palabras, un 59% alteraciones en la velocidad del habla y un 81% dificultades en la expresión verbal. En el área Audición el 100% manifestó conocer los efectos nocivos del ruido, un 37% admitió escuchar música a intensidad de alta a máxima, un 92% concurrió a lugares con música amplificada y un 87% mencionó tener síntomas posteriores a dicha exposición. El 24% presentó hipoacusia perceptiva. Un elevado número de jóvenes mostró alteraciones en las áreas estudiadas, que constituyen limitaciones en su carrera universitaria y podrían comprometer su futuro desempeño profesional.

Palabras clave: alteraciones; habla; audición; jóvenes; estudiantes universitarios.

SPEECH AND AUDITION DISORDERS IN UNIVERSITY STUDENTS.

Summary

The objectives were to detect alterations in audition, difficulties in verbal expression and phonological aspects of language; to investigate the noxious effects of noise; and to establish the presence of auditive habits and symptoms linked to the exposition to amplified music. The spot check was made in 120 young students in the Biophysics course of the career of Medicine, National University of Rosario, Argentina. The Speech area was evaluated through a survey and protocol. In the Audition area, a survey was followed by tonal audiometry. The results show that 75% presented some alteration in Speech; of this percentage, 74% in prosody and 56% in occlusion. Thirthy- seven percent of the students presented problems in the pronunciation of syllables and/or words, 59% alterations in the speed of speech and 81% difficulties in verbal expression. In the Audition area 100% had some knowledge about the noxious effects of noise, 37% admitted listening to music at high/maximum volume, 92% going to places with amplified music, and 87% mentioned having further symptoms after exposure. Twenty-four percent presented perceptive hearing loss. A high number of young people showed alterations in the studied areas, that constitute limitations in their university training and could potentially affect their future professional activity.

Key words: alterations; speech; audition; youth; university students.

Introducción

El proceso comunicativo es entendido como una interacción entre dos o más sujetos (interlocutores) que emprenden un intercambio o negociación.1 En los intercambios orales intervienen aspectos de carácter diverso que pueden influir, a veces, de manera decisiva en el buen o mal funcionamiento de la interacción. Múltiples investigaciones en el campo de la comunicación oral dan cuenta de estos conceptos.2

Las modalidades y conductas en relación a las producciones verbales, ponen de manifiesto la fluidez y la calidad del discurso. Aspectos tales como la velocidad, la entonación, las cualidades de la voz y la articulación, junto con la sintaxis y el léxico utilizado, son componentes del discurso que en tanto sean adecuados, permitirán coherencia, cohesión y una adecuada trasmisión del mensaje para producir así un intercambio efectivo.

Existen muchas prácticas discursivas en la vida social, pública, institucional y educacional (entrevistas, charlas, debates, clases, conferencias), que son difíciles de imaginar sin un adecuado uso del “habla” y sin considerar los vínculos que se crean en las mismas.

Numerosos son los estudios sobre la problemática del lenguaje en los jóvenes, que les atribuyen con frecuencia limitaciones lingüísticas tales como: mala articulación, falta de fluidez, pobreza de vocabulario, dificultad para expresar ideas adecuadamente, etc. La realidad muestra que los jóvenes en general y en particular los universitarios, deben ir adaptando sus discursos a distintos interlocutores y propósitos, ya que las exigencias lingüísticas y sociales son cada vez mayores. En el caso particular de los estudiantes de medicina, la futura relación médico-paciente, que se pondrá en juego en una consulta o entrevista, puede ser tomada como ejemplo de interacción comunicativa. Resultará fundamental en ella que el profesional posea habilidades para interrogar, escuchar, organizar con coherencia su discurso al momento de elaborar un diagnóstico y trasmitirlo a su paciente usando un lenguaje claro y con velocidad adecuada. Aspectos tales como problemas de pronunciación o falta de fluidez (entre otros) pueden operar como interferencias importantes. Asimismo, un déficit en la audición es sin duda otro factor perturbador en la comunicación.

Actualmente se asume la existencia de una relación entre pérdida auditiva y ruido social, es decir el producido por la actividades de ocio. En este sentido los jóvenes constituyen un sector de la población que presenta un potencial riesgo auditivo, ya que están sobreexpuestos a sonidos intensos. A los ruidos urbanos, se suman el hábito de escuchar música a alto volumen y la frecuente concurrencia a lugares de esparcimiento, por lo que es posible suponer que probablemente estos jóvenes iniciarán su actividad laboral con un cuadro audiológico comprometido.

Varios son los autores que realizaron búsquedas sistemáticas de los umbrales auditivos de los jóvenes. Algunos de ellos no encontraron pruebas ciertas de una correlación entre dichos umbrales y hábitos auditivos.3, 4 Sin embargo otros coincidieron en advertir que la incidencia de deficiencias auditivas es mayor en jóvenes con actividades ruidosas de tiempo libre.5-7

El presente estudio cuenta como antecedente el realizado en el año 2000 en un grupo de adolescentes entre 14 y 16 años, con el fin de detectar alteraciones auditivas y en la producción del habla. Se encontró que el 10 % de los jóvenes presentó hipoacusia perceptiva, y el 69% productos de distorsión alterados. En cuanto al habla, un 86% presentó algún tipo de alteración.8

En el período 2001-2002 se realizó una investigación referida al estudio de la comunicación en jóvenes universitarios, en relación a la función auditiva y a la producción verbal. Se plantearon como objetivos: detectar alteraciones auditivas, dificultades en la expresión verbal y en los aspectos fonológicos del lenguaje; indagar acerca del conocimiento de los efectos nocivos del ruido; establecer la presencia de hábitos auditivos y síntomas vinculados a la exposición a música amplificada.

Material y Método

Se trabajó con 120 adolescentes cursantes de la asignatura Física Biológica del 2º año de la carrera de Medicina de la UNR. Fueron estudiados todos los jóvenes que acudieron voluntariamente a la convocatoria realizada por el grupo de investigadores, en las comisiones del turno mañana.

El área Habla se estudió a través de la aplicación de una encuesta que investigó modalidades y conductas que los jóvenes reconocen en relación a sus producciones verbales y de un protocolo que evalúa las cualidades de la voz, prosodia, función articulatoria, modo respiratorio, coordinación fonorrespiratoria y oclusión, a través de la observación y la escucha de las distintas producciones.

En cuanto al área Audición, se aplicó una anamnesis, con el objeto de indagar acerca de los antecedentes otológicos personales y familiares y la presencia de síntomas auditivos. Posteriormente se le realizó a cada joven una otoscopía y una audiometría tonal, con un audiómetro Kamplex AD 28.

Concluidas las evaluaciones auditivas se procedió a interrogar a los jóvenes en forma oral en base a un cuestionario referido al conocimiento acerca de los efectos nocivos del ruido, el hábito de escuchar música a elevada intensidad, la concurrencia a lugares con música amplificada y la presencia de síntomas posteriores a la permanencia en un ambiente con música a niveles elevados.

Resultados y Discusión

Los resultados obtenidos en la evaluación del área Habla muestran que el 75% de los jóvenes presentó alteraciones. De este porcentaje, un 74% en la prosodia, prevaleciendo las modificaciones del ritmo y la velocidad, coincidentemente con las respuestas obtenidas en las encuestas, donde los jóvenes hablan con velocidad muy rápida que compromete la fluidez y la inteligibilidad. Un 56% presentó trastornos en la oclusión, observándose alteraciones dentarias y presencia de maloclusiones, encontrándose un bajo número de jóvenes con algún tipo de tratamiento odontológico previo. En un 30% se observó ausencia de coordinación fonorrespiratoria, en un 28% alteraciones en las cualidades de la voz (tono-intensidad-timbre) y en un 27% un modo respiratorio inadecuado (mixto o bucal), evidenciándose la relación entre alteraciones de la función respiratoria y la función fonatoria. Por último, un 14% de los jóvenes presentó compromiso en la función articulatoria, con dislalias de fonemas “s” y “r”. (Tabla I)

Cabe mencionar, por otra parte, que 4 jóvenes (5%) fueron identificados con tartamudez, coincidiendo este porcentaje con los referidos en las estadísticas.9

La intensidad, el tono, la entonación, el ritmo o velocidad, son elementos paraverbales fundamentales en la oralidad. La normalidad desde la fisiología y el adecuado uso desde lo pragmático, identifican a un sujeto y hacen a la efectividad de la comunicación. Tuson expresó que la calidad de la voz se modula para conseguir determinados efectos o para manifestar determinadas intenciones.2 En toda producción verbal debe reconocerse la intervención de órganos y/o estructuras y la interrelación entre las funciones articulatoria-respiratoria y fonatoria, siendo la normalidad de las mismas lo que garantizará una producción efectiva. La identificación de alteraciones en cada uno de estos aspectos es de fundamental importancia en relación a la calidad de la comunicación.10

En cuanto a los resultados obtenidos en la encuesta, un 37% de los jóvenes refirió tener problemas en la pronunciación de sílabas y/o palabras, remitiendo a dificultades de orden lingüístico relacionadas a la fluidez discursiva, tales como velocidad y continuidad. Sin embargo sólo el 9% de ellos presentaba efectivamente errores articulatorios.

Un 59% de los jóvenes refirió presentar alteraciones en la velocidad del habla. En la Tabla II se presentan las alteraciones referidas, observándose que el 92% reconoce hablar rápido; estos jóvenes presentan alteraciones en la fluidez en tanto manifiestan cortar palabras, trabarse al hablar o no terminar sus frases.

Del total de los jóvenes encuestados, 81% mencionó dificultades en la expresión verbal. Los problemas consignados fueron: expresión incorrecta de ideas (62%), necesidad de tiempo para pensar (46%), evitar o sustituir palabras (42%), imposibilidad de transmisión de conocimientos (38%) e inadecuada organización de frases (28%). Ver Tabla III.

Las dificultades en relación a la expresión verbal no se relacionan con los aspectos fonético-articulatorios, sino que remiten al desempeño lingüístico, fundamentalmente a los aspectos semánticos pragmáticos.

Para Nippold el discurso, como unidad semántico-pragmática por excelencia, requiere de un conjunto coherente de frases organizadas en torno a un tema, formulado con una intención específica en una situación comunicativa concreta.11

Pavez, en su investigación sobre el manejo del discurso en los adolescentes sin problemas intelectuales, emocionales o de aprendizaje, refiere a dificultades para describir, desarrollar una argumentación, comprender textos escritos, organizar ideas y expresarlas oralmente y por escrito, como evidencias de una “inhabilidad” o “déficit” de algunos jóvenes en el manejo discursivo, que se hace más evidente en el discurso “no conversacional” vinculado más directamente a las exigencias educativas.12

Si bien en la adolescencia continúa desarrollándose el lenguaje en los aspectos sintáctico-semántico y pragmático, este desarrollo debe ser acorde a las mayores exigencias lingüísticas, educativas y sociales que le requerirán a los jóvenes adecuar sus discursos a distintos interlocutores y propósitos. Los modismos culturales propios de los jóvenes, tales como el hablar muy rápido, el cortar palabras, la escasa modulación, funcionan en la actualidad como limitaciones en sus interacciones verbales. Evidencia de ello son los resultados encontrados en relación a lo manifestado por los jóvenes como actitudes adoptadas en una situación de exposición oralfrente al docente y/o compañeros: hablar más rápido (78%), tensión corporal (75%), desorganización (73%) e inhibición (26%). Un 73% de los jóvenes refirió que las intervenciones del docente a través de preguntas, les facilitan la organización y continuidad discursiva. A su vez un porcentaje similar (76%), manifestó un cambio de actitud según las características del interlocutor.

Los resultados obtenidos en el area Audición, muestran que 24% de los jóvenes presentó hipoacusia perceptiva. En la Tabla IV se observa la distribución de jóvenes según los resultados de la audiometría tonal. Las frecuencias más comprometidas fueron las de 3 y 6 kHz, con descensos de umbrales tonales de hasta 45 dB. El estudio de Lipscomb atribuye el déficit auditivo hallado en la frecuencia 6 kHz en una población de estudiantes, al hábito de escuchar música a muy alto volumen.13 Esta marcada caída en la frecuencia 6 kHz, también fue encontrada por Axelson y Jerson en estudiantes de escuelas secundarias. Si bien estos autores no establecieron una vinculación directa entre pérdida de la audición y hábitos auditivos, observaron que muchos de los jóvenes desarrollaban actividades de tiempo libre ruidosas, relacionadas particularmente con la música pop.14

El 100% de los jóvenes evaluados tiene conocimiento acerca de los efectos nocivos del ruido. En la Tabla V se presentan los efectos referidos, pudiéndose observar que la pérdida auditiva ocupa el primer lugar. Un menor porcentaje arrojó el estudio realizado por los autores del presente trabajo en el año 2000 (85%), sin embargo la pérdida auditiva también fue el efecto más mencionado.8

En la población de jóvenes universitarios, 33% admitió escuchar música a alta intensidad y 4% a máxima. Valores similares obtuvieron Merluzzi y Arpini en una encuesta aplicada a jóvenes italianos para estudiar la actitud de los mismos respecto a la música intensa.5

En los estudiantes secundarios evaluados en el año 2000, los valores fueron mayores, ya que un 58% declaró escuchar música a alto volumen.8

El 92% de los universitarios concurre a lugares con música amplificada, 57% de ellos 2-4 veces por mes. Un valor menor presenta Merluzzi con respecto a la población italiana, aunque el mayor porcentaje concurre también con la misma frecuencia.5

El 87% de los jóvenes universitarios que declararon asistir a lugares con música amplificada manifestó presentar síntomas posteriores a la exposición a música intensa. Los síntomas declarados se muestran en la Tabla VI, donde se observa que el acúfeno fue mencionado en el 68% de los casos. En el estudio realizado con estudiantes secundarios y en el llevado a cabo por Merluzzi se observan resultados similares; son elevados los porcentajes de jóvenes que presentaron diversos síntomas, presentándose también el acúfeno con altos valores.5,8

Conclusiones

Los datos obtenidos muestran un elevado número de jóvenes con alteraciones en el área Habla, fundamentalmente en los aspectos rítmico-prosódicos; esto coincide con las respuestas dadas en las encuestas, en las que ellos manifiestan un habla con velocidad muy rápida que compromete la inteligibilidad y la fluidez. Asimismo refieren dificultades en la organización discursiva con limitaciones en el desempeño verbal.

Con respecto al área Audición, a pesar de que la totalidad de los jóvenes encuestados tiene conocimiento acerca de los efectos nocivos del ruido sobre la salud, se observa una persistencia de prácticas auditivas inadecuadas que podría estar en relación con los descensos de los umbrales auditivos encontrados.

Un déficit en la función auditiva y/o en algunos de los aspectos implicados en la producción verbal actúa como limitación en la carrera universitaria del joven, pudiendo verse comprometido su futuro desempeño profesional. De allí la importancia de que los estudiantes en esta etapa de su formación puedan tomar conciencia de sus propias dificultades a fin de revertirlas oportunamente.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Prof. Dra. Marta L. Rasia y al cuerpo docente de la Cátedra de Física Biológica por la colaboración prestada para la realización del presente trabajo.

(Recibido: abril 2003. Aceptado: julio 2003)

TABLA I. Alteraciones en el área Habla (en todas las Tablas, la columna del medio indica el n).

Prosodia	65	74%
Oclusión	49	56%
Coordinación fono-respiratoria	26	30%
Cualidades de la voz	25	28%
Modo respiratorio	24	27%
Función articulatoria	12	14%

TABLA II. Referencia de alteraciones en la velocidad del habla

Hablar rápido	63	92%
Hablar lento	5	7%
Hablar lento y/o rápido	1	1%

TABLA III. Referencia de dificultades en la expresión verbal

Expresión incorrecta de ideas	59	62%
Necesidad de tiempo para pensar	44	46%
Evitar o sustituir palabras	40	42%
Imposibilidad transmisión conocimientos	36	38%
Inadecuada organización de frases	27	28%

TABLA IV. Resultados de la audiometría tonal

Audición normal	91	76%
Hipoacusia perceptiva bilateral	18	15%
Hipoacusia perceptiva unilateral	11	9%

TABLA V. Efectos nocivos referidos